科研人必看！免疫组化IHC实验常用固定剂配方集锦

在免疫组织化学（IHC）实验中，科研人可能会把主要精力投入到抗体选择、抗原修复和显色系统优化上，而忽略一个关键的操作步骤：固定。固定并不仅仅是“把组织泡起来”的简单操作，而是需要精心设计、严格把控的实验艺术。固定需要在分子层面“冻结”生命活动的瞬间，保持细胞形态的完整性，并保留抗原的免疫反应性。

蛋白质的物理、化学性质迥异，对应的固定方法和固定液的反应也不尽相同。

「IHC诊断室」第7期，将系统梳理IHC常用固定液配方及其配制步骤，为实验者提供一份可信赖的技术参考。一、甲醛类固定液：经典中的经典

10%中性缓冲甲醛（NBF）和4%多聚甲醛（PFA）依然是当今IHC实验中应用广泛的固定液。其固定机制在于与蛋白质中的氨基、羟基等基团形成交联，稳定组织结构。

10%中性缓冲配制较简单，常规配方如下：

4%多聚甲醛（PFA）根据实验目的和使用场景不同，有两种配制方法。

溶液一的配制步骤：

(1) 称取40 g多聚甲醛粉末，置于三角烧瓶中。

(2) 加入500-800 mL 0.1 M磷酸缓冲液（PB）。

(3) 加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮。

(4) 补足0.1 M磷酸缓冲液至1000 mL，充分混匀。

此固定液较适用于IHC研究，特别是动物灌注固定取材及后续的浸泡固定（2-24 h）。固定液较为温和，适合组织标本的长期保存。

溶液二的配制步骤：

(1) A液在500 mL的三角烧瓶中配制，加热至60℃左右溶解。至多聚甲醛完全溶解后冷却备用。

(2) 配制B液和C液。

(3) 将B液倒入C液中，混合后再加入A液。

(4) 用1N NaOH或HCl将pH值调至7.2-7.4。

(5) 加ddH₂O定容至1000 mL，4℃冰箱保存备用。

此固定液适用于光镜和电镜免疫组织或细胞化学研究。用于免疫电镜检测时，建议加入少量新鲜配制的戊二醛（终浓度为0.5-1%）。戊二醛属于双醛类固定剂，交联能力比甲醛强，有利于保存超微结构，但对抗原性的损伤也较大。在IHC实验中，戊二醛与甲醛联合使用，能够满足结构保存和抗原保留平衡的需求。

二、传统固定液的改良与创新

2.1 Bouin's液及其改良配方

Bouin's液是组织学和病理学的传统固定剂，由bitter acids、甲醛和冰醋酸组成。bitter acids沉淀蛋白引起组织收缩，但不会使组织硬化。Bouin's液对组织穿透力较强，固定效果好，对细胞的微细结构显示清晰，适用于富含结缔组织、胚胎及植物组织的标本，尤其在Masson三色法中，经其固定后组织着色鲜艳。

Bouin's液常规配方为饱和bitter acids750 mL、40%甲醛250 mL、冰醋酸50 mL，混合后移至棕色瓶中，存于4℃冰箱。冰醋酸临用前加入。改良版Bouin's液不加冰醋酸。

Bouin's液常规固定时间为12-24小时。由于该固定液呈酸性（pH 3-3.5），对抗原可能有一定损害，在固定1-2天后需换入4%的甲醛溶液中保存。

目前常用市售饱和bitter acids溶液直接配制。如果你手上是bitter acids粉末，则需要一种“邪修”方案了。首先在烧杯中加入1000 mL蒸馏水，并不断加入bitter acids粉末，边加边搅拌，直至有少量bitter acids结晶出现为止。静置并过滤。然后取750 mL bitter acids溶液与250 mL 40%甲醛混匀。最后加入冰醋酸。

2.2 Zamboni's液配方及其配制

Zamboni's固定液对超微结构的保存效果好于甲醛，可用于电镜和显微镜IHC检测。实验室常用配方为2.5%的多聚甲醛和30%的饱和bitter acids，固定时间控制在6-18小时。

2.3 PFG固定液的配制

PFG固定液由对苯醌、多聚甲醛和戊二醛构成，结合了甲醛快速渗透和戊二醛的蛋白交联能力，又不影响超微结构的保存，适用于电镜样本的制备或对结果稳定性要求高的IHC实验。

2.4 Karnovsky's固定液配制

适用于电镜免疫化学检测，在4℃短时固定效果好。推荐的操作流程为：先进行灌注固定，随后浸泡固定10-30分钟。“短时冷固定”策略已成为保存超微结构和肽类抗原的常用方法。

读到这里，你是否发现IHC固定液的世界远比“倒点甲醛泡一泡”要精彩的多，甲醛的“好搭子”远超想象。不同的组合、不同的配比，将会在组织或细胞结构中呈现不一样的结果。掌握这些固定液的配制方法，将会获得一张特异性强、背景干净的精美片子。