应用分享｜重组人生长激素Fc免疫融合蛋白含量的SEC-HPLC测定

1) 样品溶液配制：标准品溶液的配制取GH标准品1支 (蛋白含量为1 mg)，精密加入注射用水1.0 mL溶解，制成浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液。

2) 标准曲线溶液配制：取rhGH-Fc免疫融合蛋白样品，经Lowry法测定蛋白浓度约为3.07 mg/mL，用注射用水稀释，配制成以下6个浓度: 0.307、0.614、0.860、1.228、1.596、1.842 mg/mL。

色谱柱：TSKgel G2000SWXL（7.8 mmI.D.×30 cm, 5 μm）

流动相：0.05 mmol/L磷酸盐缓冲液+0.3 mol/L氯化钠（pH到6.8）

流速：0.6 mL/min

进样体积：100 μL

柱温：45℃

检测器参数：UV@280 nm

图1  rhGH-Fc样品、rhGH-Fc对照品、GH对照品及蛋白缓冲叠加色谱图（A: 样品、B: 对照品、C: GH国家对照品；D: 蛋白缓冲液(50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液) ）

图2  峰面积与浓度线性关系图

采用TSKgel G2000SWXL建立的重组人生长激素-Fc免疫融合蛋白含量测定方法，分离谱图见图1，rhGH-Fc免疫融合蛋白样品与对照品出峰时间一致，GH国家标准品与对照品出峰时间不同，蛋白缓冲液不出峰，表明方法专属性良好。

线性考察结果见图2，在浓度范围0.307~1.842 mg/mL范围内，峰面积与样品浓度，线性关系良好 (R²=0.9994)，平均回收率在91.0%~100.4%之间，表明该方法准确度良好。该方法的定量限为：6.0 μg/mL。

综上所诉，利用SEC-HPLC进行蛋白含量检测比Lowry法更加灵敏高效，可缩短检测时间。该方法系统适用性、专属性、精密性良好，准确性较高，有利于为纯化工艺提供数据支持。