《GB 5009.88-2023 食品中膳食纤维的测定》看这一篇就够了！

海能DF06膳食纤维测定仪， K1160全自动凯氏定氮仪，SH520自动消解仪，马弗炉，分析天平等。

1、仪器准备

（1）将滤膜编号，于105℃烘箱中烘干至恒重并称重为M_G后，安装于过滤漏斗中，并安装至仪器相应位置处。

（2）移取350 μL的热稳定α-淀粉酶溶液  ，溶于盛有50 mL的顺丁烯二酸缓冲溶液的酶瓶中，然后将酶瓶安装至仪器相应位置处；700 μL的50 mg/mL蛋白酶溶液，溶于盛有50 mL的顺丁烯二酸缓冲液的酶瓶中，然后将酶瓶安装至仪器相应位置处；移取700 μL的淀粉葡萄糖苷酶溶液，溶于盛有50 mL的顺丁烯二酸缓冲液的酶瓶中，然后将酶瓶安装至仪器相应位置处。

（3）确保95%乙醇、纯水（三级，下同）、顺丁烯二酸缓冲液、醋酸溶液的对应试剂桶中试剂充足，然后将其与对应接头连接。

2、准确称取样品0.25 g（精确至0.1 mg），使用称量纸盛放，注意避免气流吹拂样品导致质量损失。

3、HMWDF（高分子量膳食纤维，即不可溶性膳食纤维ISDF与可溶性可沉降性膳食纤维SDFP之和）的测定。

（1）设定酶解程序如下：

（2）在运行-第一法中选定设定酶解程序，开始运行，并按照步骤将酶解袋安装至仪器对应位置处，然后按照步骤提示将样品倒入酶解袋中。（注意避免样品粘在酶解袋内壁高于上压条，否则应用带针头的注射器吸取缓冲液将样品冲入酶解袋，冲洗体积不超过两毫升）。

（3）仪器自动进行酶解、乙酸溶液添加。然后根据弹窗提示测定（或需添加1 mol/L氢氧化钠溶液或乙酸溶液调整）空白、样品的pH值为4.3±0.2，然后向需测定不可沉降性膳食纤维（SDFS）的样品中准确加入2 mL的100 mg/mL的二甘醇内标液。

（4）仪器自动进行95%乙醇添加、计时沉淀、抽滤和残渣洗涤。若抽滤结束后，内斗中仍存有滤液，则需在调试界面手动开启抽滤，将滤液全部收集至抽滤瓶中。程序结束后，得到滤液与TDF的残渣，将附有残渣的滤纸取出，按照十字折叠后放置于样品架上，在105℃烘箱中烘干至恒重（至少需4小时）并称重为M_GR。

4、每两份残渣中，一份按照国标《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》第一法进行消解（推荐试剂量为硫酸铜0.2 g、硫酸钾3 g、硫酸20 mL，420℃下保温时间至少为3小时），蒸馏、滴定，计算蛋白质质量M_P；另一份置于马弗炉中，于550℃下灰化3 h测定灰分，计算灰分质量M_A。

5、用量筒移取200 mL滤液至烧瓶中，设定旋转蒸发仪的参数为50°C～80°C，转速为100 rpm，然后将盛有滤液的烧瓶安装到旋转蒸发仪对应位置处，将滤液旋蒸至近干。

6、用20 mL纯水将近干溶液复溶。充分溶解后，取5 mL溶液至离心管中，离心管中提前分别加入2 g的阴离子交换树脂（OH^-）和氢离子交换树脂（H⁺），然后反复颠倒混合至少5分钟进行脱盐，静置10分钟后将上清液转移至新的离心管中。再向有离子交换树脂的离心管中加入5 mL纯水，重复颠倒混合和静置的过程，然后将上清液合并至新的离心管中。

7、将脱盐后的溶液过0.45 μm水相膜后，上K2025高效液相色谱仪检测，按照参考国标设置液相色谱仪的参数。

8、HMWDF计算

试剂空白按下公式计算：

M_B：试剂空白质量，g；

：试剂空白残渣质量，g；

M_BP：试剂空白残渣中蛋白质质量，g；

M_BA：试剂空白残渣中灰分质量，g。

HMWDF按下公式计算，书写相同的参数应对应好相应的测试指标：

M_GR：试样残渣及处理后滤膜质量，g；

M_G：处理后滤膜质量，g；

X：试样中膳食纤维含量，%；

M_P：试样残渣中蛋白质质量，g；

M_A：试样残渣中灰分质量，g；

M_B：试剂空白质量，g；

M：试样取样量，g；

f：试样因脱水、脱糖、脱脂导致质量变化的校正因子，若样品经多次处理，则将每个校正因子相乘，得到总的校正因子；若试样无需处理，则为1；

M_C：试样预处理前质量，g；

M_D：试样预处理后质量，g；

表1  三种抗性麦芽糊精中高分子量膳食纤维（HMWDF，IDF+SDFP）的含量测定结果

使用海能DF06膳食纤维测定仪测定抗性糊精式样中的高分子量膳食纤维（HMWDF）的含量，本试验采用了GB 5009.88-2023 中规定的第一法。三种抗性糊精的测得值分别为2.70%、0.38%、2.08%，结果精密度分别为6.02%、7.00%、9.76%，均满足2次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值20%的要求。表明测试平行性良好，DF06膳食纤维测定仪适用于《GB 5009.88-2023 食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》中以酶重量法的方式测定抗性糊精样品中高分子量膳食纤维（HMWDF）含量的测定。

悟空K2025高效液相色谱仪：K2025P2二元高压输液泵、K2025AS自动进样器、K2025PlusCO柱温箱（立式）、K2025RID示差折光检测器、Wookinglab色谱工作站；

色谱柱：Shodex OHpak LB-802.5，8.0×300 mm，6 μm或者相当的色谱柱，两根色谱柱串联；

保护柱：Shodex OHpak LB-G 6B，6.0×50 mm，13 μm；

流动相：水（符合GB/T 6682规定的一级水）；

流   速：0.5 mL/min；

进样量：20 μL；

洗针液：水（符合GB/T 6682规定的一级水）；

柱   温：80 ℃;

检测器及参数：检测器为示差折光检测器，检测器温度为50 ℃；

洗脱时间：60 min。

 1、SDFS保留时间的确定

待仪器工作状态稳定后，将定性用标准溶液按照上述色谱条件上机测定，平行测定2次。根据蔗果三糖和D-麦芽糖保留时间和基线分离效果，确定碳水化合物聚合度＞3与聚合度＜3的分界值及待测组分保留时间区间，定性用标准溶液连续2针进样叠加色谱图如图1，积分结果如表2所示。

图1  定性用标准溶液叠加色谱图

表2  定性用标准溶液色谱图积分结果

依据图1及表2可知，由定性用标准溶液色谱图中蔗果三糖和D-麦芽糖保留时间和基线分离效果，确定不可沉淀的可溶性膳食纤维（SDFS）与双糖的分界值为36.520 min。

2、重复性测试

将D-葡萄糖/二甘醇标准工作液（D-葡萄糖和二甘醇含量均为2.0 mg/mL）连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表3。

图2  D-葡萄糖/二甘醇标准工作液连续进样7针叠加的色谱图

表3  D-葡萄糖/二甘醇标准工作液连续进样7针重复性数据统计

由表3中数据可知，将D-葡萄糖/二甘醇标准工作液（D-葡萄糖和二甘醇含量均为2.0 mg/mL）连续进样7针进行重复性测试，葡萄糖保留时间的RSD为0.04%，峰面积的RSD为0.50%；二甘醇保留时间的RSD为0.02%，峰面积的RSD为0.33%，均具有良好的定性定量重复性。

3、D-葡萄糖响应因子（R）的确定

待仪器工作状态稳定后，将D-葡萄糖/二甘醇标准系列工作液按照色谱条件上机测定。

图3  D-葡萄糖/二甘醇标准系列工作液叠加色谱图

表4  D-葡萄糖/二甘醇标准系列工作液的校准曲线

由表4中校准曲线结果可知，葡萄糖在0.5 mg/mL~8.0 mg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，曲线的确定系数R²＞0.999，D-葡萄糖响应因子（R）为1.33446。

4、SDFS测定

将脱盐后试样测定液上机测定，根据聚合度＞3聚合物峰面积（PA_SDFS）和二甘醇峰面积（PA_Is）计算SDFS含量，计算公式如下：

X_SDFS：为试样中SDFS的含量，单位为 g/100g；

PA_SDFS为试样测定液中待测物质峰面积，单位为μRIU·s ；

PA_IS：为试样测定液中内标物峰面积，单位为μRIU·s ；

m_IS：为试样酶解液中加入内标物质量，单位为mg；

m：为试样称量质量，单位为g；

Rf：为标准物质与内标物质响应因子，此处响应因子=1.33446；

f：为试样因脱水、脱糖、脱脂导致质量变化的校正因子，若样品经多次处理，则将每个校正因子相乘得到总的校正因子；若试样无需处理，则为1；

100：为转换为百分比含量的系数；

1000：为毫克转换为克的系数。

以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留至小数点后2位。

图4  抗性麦芽糊精1试样的色谱图

依据公式进行计算，试样中经高效液相色谱仪测得的SDFS的含量结果如表5所示。

表5  试样中SDFS含量结果表

从表5中结果可知，三个试样的2次平行测试中，精密度分别为5.64%、7.88%、6.63%，均满足2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%的要求。

使用悟空K2025高效液相色谱仪测定抗性糊精试样中不可沉淀的可溶性膳食纤维（SDFS）的含量。本实验以水为流动相，经SEC凝胶色谱柱分离，采用示差折光检测器检测，实验结果表明：

• 由定性用标准溶液色谱图中蔗果三糖和D-麦芽糖保留时间和基线分离效果，确定不可沉淀的可溶性膳食纤维（SDFS）与双糖的分界值为36.520min；

  
  

• 连续进样7针重复性测试中，葡萄糖保留时间的RSD为0.04%，峰面积的RSD为0.50 %；二甘醇保留时间的RSD为0.02%，峰面积的RSD为0.33%，均具有良好的定性定量重复性；

  
  

• 葡萄糖在0.5 mg/mL~8.0 mg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，曲线的确定系数R²＞0.999，D-葡萄糖响应因子（R）为1.33446；

  
  

• 三个试样的2次平行测试中，精密度分别为5.64%、7.88%、6.63%，均满足2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%的要求。

因此，悟空 K2025高效液相色谱仪配备示差折光检测器，可用于《GB 5009.88-2023 食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》中不可沉淀的可溶性膳食纤维（SDFS）的含量测定。

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