高速SCMOS斜面显微镜在心肌细胞钙动力学研究中的应用

（论文部分内容摘抄）

斜面显微镜(OPM)是一种光片显微镜，它使用单个高数值孔径显微镜目标物进行荧光激发和收集。本文介绍了OPM的相对收集效率的测量方法然后引入一个包含两个sCMOS相机的OPM系统使单个分离的心肌细胞能够以每秒667帧的960x200像素连续研究22秒，以每秒960x200像元连续研究30秒。960x200X20个体素，每秒25卷。在这两种情况下，OPM能够记录在两个光谱通道，使细胞内钙通过探针与肌膜和横管网络通过膜染料同时进行研究。OPM系统，然后被应用到确定自发钙波的空间起源，并测量其起源点的细胞横向小管结构。进一步的结果表明，OPM系统也可以用于研究钙火花参数，取决于它们与横向小管结构的关系。

图为系统的实验配置示出在样品平面中放置一个荧光球(蓝色)。球体中激发荧光的区域用绿色表示。球面像是在光学系统的像面上成像的。详见正文。M镜、直流二向色放大器、AOTF声光可调滤光片、单模光纤、L-球面透镜、C-圆柱透镜、FP-前焦平面、BFP-后焦平面、0-显微镜物镜、TL-显微管透镜、EM-发射滤光片。

Fluo-4和CMO的激发波长分别为488nm和561nm。在01的后孔处，每个波长对应的激发功率约为280 uW。该功率分布在覆盖整个系统视场宽度的照明片上(氧气限制为400um)，比sCMOS相机拍摄的234x49um的视场要大。

每个2-D采集包括每个sCMOS相机上的15,000帧960x200像素。相机集成时间被设置为1.46毫秒帧间时间为1.5毫秒，从而达到每秒667帧的同步采集率，总持续时间为22.5秒。这两个图像堆栈表示不同信道被同步获取，然后使用从美国空军1951年测试图的图像确定的校正参数共同登记。

图2心肌细胞内t管位置的识别。((a)单个分离心肌梗死心肌细胞的CMO图像。红色表示CMO的荧光强度，白色表示感兴趣的肌膜区(ROI)。(B)图A所示图像的傅里叶变换。图A中红色交叉点位置是手动定位的高空间频率，对应于t-管结构。图B中红色交点位置对应于t管结构。(C)和(D)分别为单侧和双侧高斯空频滤波器。(E)计算的归-化t-小管调制图M，-(F)计算的t-小管位置的二进制图(A)、(E)和(F)中的标条代表10um。(B)、(C和(D)中的尺度条代表0.25um-1的空间频率。

我们提出了OPM相对于在常规显微镜中直接检测荧光信号的收集效率的测量，并表明在我们的设置中，OPM角度为35°时，其收集效率为21%。作为这种较低检测效率的交换条件，OPM具有与所有光片显微技术相关联的优点，即只有被成像的焦平面被照明，也就是说，没有平面外的光漂或光毒，也没有图像处理或移动部件需要获得光学切片图像，使光学切片图像能够以成像摄像机的帧速率直接获得。

通过新颖的OPM的使用，我们已经能够第一次定位的起源Ca2+波在3-D。我们对细胞进行双重染色，使其起源于肌细胞的t管结构。在对少量HF细胞(n=5)的初步研究中，我们发现HF肌细胞中较大的波频率不是来自异常的脱管区，而是来自保留t-管组织的区域。火花也被发现在高t-tubule组织的区域更频繁，特别是在上皮层区。火花的形态也因管旁区火花较大和较长的区域而不同。需要进一步的研究来证实这些结果在一个更大的细胞的规定。

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