游离脂肪酸（FFA）是婴儿配方奶粉和牛奶中营养和风味成分不可或缺的一部分。除了作为能量来源外，FFA还充当脂溶性维生素（如A、D、E和K）的重要载体。此外，FFA还通过建立保护性脂肪层为婴儿提供物理保护，同时促进视觉和神经系统的发育。
然而，脂质在降解过程中会生成醛、酮和醇等物质，这一降解过程又会产生一种令人不悦的“酸败”风味2。此外，脂肪酸氧化还会导致乳制品适口性下降、品质劣变。因此，对婴儿配方奶粉和牛奶中的FFA进行系统性筛查至关重要，涵盖了质量控制（QC）、产品改进、认证和法规合规性等多种关键功能。
目前脂肪酸常用分析手段：
HPLC | 耗时，且需要极性相对较低的色谱柱 |
GC | 衍生，将脂肪酸转化为脂肪酸甲酯 （FAMES） |
UPCC | 无需衍生、快速且可拆分异构体 |
LC-MS | 无需衍生，快速且专属性强 |
沃特世基于ACQUITY QDa II质谱检测器开发的FFA分析方法，精简且高效。
即开即用的质谱，实时、定性和定量LC-MS方法开发；
可在不到6 min内快速实现19种FFA(C8:0~C24:0)的色谱分离；
专属性，利用质量数信息区分保留时间相似但质量数不同的化学组分；
高灵敏度和高重复性的方法。
表1. 液相色谱参数。
表2. 液相色谱梯度。
表3. MS参数。
用于分析的GLC参比标准品426(包含20种游离脂肪酸，范围从C6:0到C24:0)购自Nu-Chek Prep(美国明尼苏达州)。标准品中各组分的重量百分比范围为2%~16%(表3)。混标中各FFA组分的浓度与真实样品中的浓度相近。
表4. 混标中的游离脂肪酸。
将市售牛奶和婴儿配方奶粉样品用甲醇（MeOH）(1:5)稀释，然后在10,000 g下离心5 min。得到的上清液用去离子水（1:5）进一步稀释。然后用流动相A和B(1:1)稀释溶液，并转移到LC样品瓶中进行LC-MS分析。
色谱条件筛选
由于烃链的长度和羧酸等官能团的存在，FFA的极性可能有所不同。碳原子数较少的短链FFA的极性通常较低，而碳原子数较多的长链FFA由于羧酸基团的存在，极性往往更高。本应用中测试了三种ACQUITY UPLC色谱柱，分别为AX BEH C18、CSH C18和BEH苯基柱。使用BEH苯基柱时，在6 min的梯度内，20种混合物组分（范围从C8:0到C24:0）中有19种组分实现了理想的峰分离。
无论流动相B的组成如何，均可得出结论：流动相A中的1 mM甲酸铵水溶液（NH4HCO4）对于电离样品中的FFA至关重要。浓度高于1 mM的NH4HCO4会显著降低信号强度（图1）。
图1. 当在流动相A中使用2 mM NH4HCO4（红色）代替1 mM NH4HCO4（绿色）作为添加剂时，信号强度减少了五倍。每次测试的柱上混标上样量为10 ng。
测试了甲醇、乙腈和异丙醇，最终的方法条件是以ACN作为流动相B，因为这样对于混标中的大多数FFA而言，该方法的峰分离效果良好、灵敏度较高，定量下限（LLOQ）<10 pg/μL(ppb)，对应于婴儿配方奶粉或牛奶样品中的0.01 mg/L(表7)。
为使游离脂肪酸（FFA）从LC色谱柱上有效洗脱，需要采用高有机相条件。当将流动相B%由55%提升至90%时，所有化合物在1分钟内迅速从色谱柱中洗脱出来。与之相比，采用从55%逐步过渡至80%的梯度条件则获得了理想结果，实现了良好的峰分离效果（图2）。这种优化的峰分离为混合物中各FFA的单离子扫描（SIR）采集模式应用提供了基础。具体实施方法是将采集方法划分为5个独立的SIR时间窗口，每个窗口涵盖3~5种不同的FFA组分。
图2. FFA混标的峰分离需要使用有机相从高逐渐到低的梯度。FFA标准品的柱上进样量分别为最高10 ng和最低5 ng。
图3展示了为FFA分析选择的最终LC-MS方法获得的色谱图。在评估一系列方法开发因素后，确定以1 mM NH4HCO4水溶液和ACN分别作为流动相A和B，并在BEH苯基柱上以B%从55%~80%为梯度（表1和表2）。
图3. 使用包含所有19种目标FFA的五个不同时间窗口进行的SIR采集。每个SIR窗口和FFA峰以不同颜色和字母突出显示。
灵敏度和重现性评估
此外，该方法对所有浓度低于10 pg/μL的FFA组分均表现出高灵敏度，并在高浓度和低浓度条件下均具有良好的重现性，所有组分的%RSD均在0.3%~8.2%之间。
表5. 混标中19种FFA组分的重复性数据。ppb浓度的差异反映了混标中的丰度相对百分比。*二十四烷酸的%RSD较高可以用临近运行结束时的化学噪音增加来解释。
定量下限（LLOQ）确定为20:1 S/N(通过均方根（RMS）计算)，以及峰面积达到空白响应的五倍。
表6. 混合物中19种FFA组分的LLOQ。*在硬脂酸中观察到峰干扰。
使用基质样品进行初步方法验证
为评估此方法的适用性，我们评估了选定的基质样品（图4）。牛奶和婴儿配方奶粉样品中的FFA采用简单的甲醇萃取法进行萃取，并在LC-MS分析前用流动相A和B进一步稀释（1:1）。尽管在牛奶和婴儿配方奶粉中，FFA在脂肪中所占的比例不到2%，均能检出，且FFA浓度结果与制造商和文献报道的水平一致5,6。
图4. 方法性能在真实样品中的示例。A)混标中1.6 pg/μL的棕榈酸；B)婴儿配方奶粉中13.3 ng/μL的棕榈酸；C)混标中4 pg/μL的月桂酸；D)全脂牛奶中3.7 ng/μL的月桂酸。
该方法展示了在FFA快速、高样品通量分析（每天最多可分析240个样品）中的适用性。
综上，将ACQUITY I-Class UPLC与
ACQUITY QDa II质谱检测器联用，并结合ACQUITY UPLC BEH苯基柱的创新分析方法，在游离脂肪酸分析方面展现出了明显优势。
该方法不仅可以确保在六分钟内快速准确地分离从C8:0到C24:0的各种FFA，还可以为实验室带来潜在的实质性益处，例如显著节省成本，同时大幅简化了复杂的操作步骤。
此外，该方法还可以节省大量时间（典型的GC-MS分析中，每个样品通常需要20分钟至1小时），帮助研究人员提高生产力和通量，从而提高实验室的运营效率。集速度、灵敏度和简便性于一身。
参考资料
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