悬浮细胞的siRNA转染步骤

一、引言

二、实验材料与设备

（一）实验材料

1. 悬浮细胞系：根据研究目的选择合适的悬浮细胞系，如血液细胞系（如淋巴细胞、白血病细胞等）、肿瘤细胞系（如淋巴瘤细胞等）。确保细胞处于良好的生长状态，无微生物污染。

2. siRNA：针对目标基因设计合成的 siRNA，其序列应经过严格的筛选和验证，以确保具有高效的基因沉默效果。同时，需准备阴性对照 siRNA，用于排除非特异性转染效应。

3. 转染试剂：选择适用于悬浮细胞的转染试剂，常见的有脂质体转染试剂、阳离子聚合物转染试剂等。不同的转染试剂具有不同的转染效率和细胞毒性，需根据细胞类型和实验要求进行选择。

4. 细胞培养基：适合所选悬浮细胞生长的培养基，通常包含必需的营养成分、生长因子和血清等。培养基应在无菌条件下配制和保存。

5. 无菌 PBS（磷酸盐缓冲液）：用于洗涤细胞，保持细胞的渗透压和 pH 稳定。

6. 细胞培养耗材：如培养瓶、离心管、移液器吸头、培养板等，均需经过高压灭菌处理，确保无菌。

（二）实验设备

1. 细胞培养箱：提供适宜的温度（通常为 37°C）、湿度（通常为 95%）和二氧化碳浓度（通常为 5%），以维持细胞的正常生长和代谢。

2. 离心机：用于细胞的离心收集和洗涤，转速和离心时间需根据细胞类型和实验要求进行调整。

3. 倒置显微镜：用于观察细胞的形态和生长状态，在转染过程中可实时监测细胞的健康状况。

4. 移液器：包括不同量程的单道移液器和多道移液器，用于准确量取细胞悬液、培养基和转染试剂等。

5. 无菌操作台：提供无菌操作环境，防止微生物污染实验样品。

6. 荧光显微镜（可选）：如果使用带有荧光标记的 siRNA 或转染试剂，可通过荧光显微镜观察转染效率和细胞内 siRNA 的分布情况。

三、转染步骤

（一）细胞培养与计数

1. 在无菌条件下，将悬浮细胞接种于合适的培养瓶或培养板中，加入适量的细胞培养基，轻轻摇匀，使细胞均匀分布。

2. 将细胞培养物置于细胞培养箱中，在适宜的条件下培养，定期观察细胞的生长状态，确保细胞处于对数生长期。

3. 在转染前，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，根据实验要求调整细胞浓度至合适的范围（通常为 [X] - [X] cells/mL）。

（二）siRNA 与转染试剂的准备

1. siRNA 稀释：根据实验设计，将所需量的 siRNA 干粉溶解于适量的无 RNA 酶的 ddH₂O 或专用的 siRNA 稀释缓冲液中，轻轻混匀，制备成一定浓度的 siRNA 储存液（通常为 20 μM）。然后，将 siRNA 储存液进一步稀释至工作浓度（通常为 50 - 200 nM），可根据转染试剂的说明书和细胞类型进行优化。

2. 转染试剂稀释：按照转染试剂说明书的要求，将转染试剂用无血清的细胞培养基稀释至适当的浓度。一般情况下，转染试剂与 siRNA 的比例需通过预实验进行优化，以达到最佳的转染效率和最小的细胞毒性。

（三）siRNA - 转染试剂复合物的形成

1. 在无菌离心管中，将适量稀释后的 siRNA 溶液与等体积或相应比例的稀释后的转染试剂溶液轻轻混合，避免剧烈振荡，以免破坏复合物的形成。

2. 将混合液在室温下孵育一定时间（通常为 15 - 30 分钟），使 siRNA 与转染试剂充分结合，形成稳定的 siRNA - 转染试剂复合物。

（四）细胞转染

1. 将培养中的悬浮细胞轻轻摇匀，吸取适量的细胞悬液（根据实验要求和细胞密度确定）转移至新的无菌离心管中。

2. 将预先制备好的 siRNA - 转染试剂复合物缓慢滴加到含有细胞悬液的离心管中，边滴加边轻轻摇匀，使复合物均匀分布于细胞悬液中。

3. 将转染后的细胞悬液转移回培养瓶或培养板中，轻轻摇匀，然后将培养物置于细胞培养箱中，在适宜的条件下继续培养。

（五）转染后培养与检测

1. 转染后培养：根据细胞类型和实验目的，确定转染后的培养时间。在培养过程中，定期观察细胞的生长状态和形态变化，如有必要，可更换新鲜的细胞培养基，以维持细胞的正常生长和代谢。

2. 转染效果检测：在转染后的适当时间点，可通过多种方法检测 siRNA 的转染效果和目标基因的沉默效率。

• 荧光检测（如果使用荧光标记的 siRNA 或转染试剂）：使用荧光显微镜观察细胞内的荧光信号，评估转染效率。通过计算发出荧光的细胞数占总细胞数的比例，可得到大致的转染效率。

• qRT - PCR 检测：提取转染后细胞的总 RNA，反转录为 cDNA，然后利用实时荧光定量 PCR 技术检测目标基因的 mRNA 表达水平。与未转染或阴性对照转染的细胞相比，目标基因 mRNA 表达水平显著降低表明 siRNA 成功沉默了目标基因。

• Western blot 检测：收集转染后细胞的蛋白质，通过 Western blot 技术检测目标蛋白的表达水平。目标蛋白表达量的减少可进一步证实 siRNA 对目标基因的沉默效果。

四、注意事项与优化策略

（一）注意事项

1. 细胞质量控制：确保使用的悬浮细胞处于良好的生长状态，无微生物污染和其他异常情况。定期对细胞进行传代培养，避免细胞老化对转染效率和实验结果的影响。

2. 实验操作规范：在整个转染过程中，严格遵守无菌操作原则，防止微生物污染。使用无 RNA 酶的耗材和试剂，避免 RNA 降解。操作过程中尽量减少对细胞的机械损伤，保持细胞的完整性。

3. 转染试剂选择与优化：不同的悬浮细胞系对转染试剂的敏感性和适用性不同。在选择转染试剂时，需参考其说明书和相关文献，了解其对特定细胞类型的转染效率和细胞毒性。同时，通过预实验优化转染试剂与 siRNA 的比例、转染时间和细胞密度等参数，以提高转染效率并降低细胞毒性。

4. siRNA 质量控制：合成的 siRNA 应具有较高的纯度和完整性。在使用前，可通过琼脂糖凝胶电泳等方法检测 siRNA 的质量，确保其无降解和杂质污染。同时，注意 siRNA 的保存条件，避免反复冻融。

（二）优化策略

1. 优化细胞密度：适当调整转染时的细胞密度，过高或过低的细胞密度都可能影响转染效率。一般来说，需通过预实验确定每种细胞系的最佳转染细胞密度。

2. 选择合适的转染方法：除了常规的脂质体转染和阳离子聚合物转染外，还有电穿孔转染、病毒载体介导的转染等方法可供选择。对于某些难以转染的悬浮细胞系，可尝试不同的转染方法，以找到最适合的转染方式。

3. 使用转染增强剂：在转染过程中，可添加一些转染增强剂，如细胞松弛素 B、氯喹等，来提高转染效率。但需注意转染增强剂的浓度和作用时间，避免对细胞造成过度损伤。

4. 优化培养条件：调整转染后的培养条件，如培养基成分、培养温度和二氧化碳浓度等，也可能对转染效果产生影响。例如，某些细胞在较低的温度下培养可能有助于提高转染效率。

五、结论