探讨 siRNA 转染至细胞的可行方法

一、引言

二、siRNA 转染的物理方法

（一）电穿孔法

1. 原理：电穿孔法是利用短暂的高压电脉冲在细胞膜上形成瞬时的小孔，使 siRNA 能够通过这些小孔进入细胞内。电脉冲的强度、持续时间以及细胞的类型和状态等因素都会影响转染效率。

2. 操作步骤

• 细胞准备：将处于对数生长期的细胞收集并悬浮在适当的电穿孔缓冲液中，调整细胞浓度至合适范围。

• siRNA 与细胞混合：将 siRNA 加入到细胞悬液中，轻轻混匀。

• 电穿孔操作：将混合后的细胞悬液转移至电穿孔杯中，设置合适的电穿孔参数（如电压、电容等），进行电脉冲处理。

• 细胞培养：电穿孔后，立即将细胞转移至培养皿中，加入适量的培养基，在适宜的条件下培养，以促进细胞恢复和 siRNA 的作用发挥。

3. 优点

• 转染效率相对较高，尤其对于一些难以转染的细胞类型，如原代细胞等，具有一定的优势。

• 适用范围广，能够用于多种细胞类型的转染。

4. 缺点

• 需要专门的电穿孔设备，成本较高。

• 电脉冲可能对细胞造成一定的损伤，影响细胞的存活率和生理功能，需要优化电穿孔条件以减少细胞损伤。

（二）基因枪法

1. 原理：基因枪法又称微粒轰击法，是利用高压气体将包裹有 siRNA 的微小金粒或钨粒等载体加速至高速，直接轰击细胞，使 siRNA 进入细胞内。

2. 操作步骤

• 微粒制备：将 siRNA 与金粒或钨粒等载体混合，在特定的缓冲液中使 siRNA 吸附到微粒表面。

• 基因枪装置准备：调整基因的参数，如轰击压力、距离等，确保微粒能够准确地轰击到细胞。

• 细胞处理：将细胞接种在合适的培养皿或载玻片上，使其形成单层细胞。

• 轰击操作：将装载有 siRNA 的微粒放入基因枪的弹仓中，进行轰击操作，使微粒携带 siRNA 进入细胞。

• 后续培养：轰击后的细胞在适宜的条件下培养，观察 siRNA 的转染效果和基因沉默情况。

3. 优点

• 不受细胞类型的限制，对于一些植物细胞、组织块以及难以常规转染的细胞等具有较好的适用性。

• 能够实现局部转染，对于研究特定组织或细胞区域的基因功能具有优势。

4. 缺点

• 设备较为复杂，操作相对繁琐。

• 可能对细胞造成物理损伤，并且转染效率的稳定性相对较差，需要优化各种参数以提高转染效果。

三、siRNA 转染的化学方法

（一）脂质体转染法

1. 原理：脂质体是一种由磷脂双分子层组成的人工膜结构，具有亲水性和疏水性。当脂质体与 siRNA 混合时，通过静电作用或其他相互作用，siRNA 能够被包裹在脂质体的内部水相中或吸附在脂质体的表面。然后，脂质体与细胞膜融合，将 siRNA 释放到细胞内。

2. 操作步骤

• 脂质体试剂准备：根据细胞类型和实验需求选择合适的脂质体转染试剂，并按照说明书进行准备。

• siRNA 与脂质体混合：将 siRNA 和脂质体分别稀释在适当的缓冲液中，然后将两者按照一定的比例混合，轻轻混匀，在室温下孵育一段时间，使 siRNA 与脂质体充分结合形成脂质体 - siRNA 复合物。

• 细胞培养：将细胞接种在培养皿或培养板中，培养至合适的细胞密度。

• 转染操作：将脂质体 - siRNA 复合物缓慢加入到细胞培养液中，轻轻摇匀，使复合物与细胞充分接触。然后将细胞在适宜的条件下培养，以实现 siRNA 的转染和基因沉默。

3. 优点

• 转染效率较高，对于多种细胞类型都具有较好的适用性。

• 操作相对简单，不需要特殊的设备。

• 脂质体试剂种类丰富，可根据不同的细胞类型和实验要求进行选择和优化。

4. 缺点

• 脂质体可能对细胞具有一定的毒性，影响细胞的存活率和生理功能，需要优化脂质体的用量和转染条件。

• 转染效果可能受到血清等因素的影响，在实验过程中需要注意控制这些因素。

（二）聚合物转染法

1. 原理：聚合物转染法是利用一些阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（PLL）等，与 siRNA 通过静电作用形成复合物。这些阳离子聚合物能够与带负电荷的细胞膜相互作用，通过内吞作用将 siRNA 带入细胞内。然后，在细胞内的酸性环境下，聚合物 - siRNA 复合物发生解离，释放出 siRNA，进入细胞质中发挥基因沉默作用。

2. 操作步骤

• 聚合物试剂准备：选择合适的阳离子聚合物转染试剂，如 PEI，并根据实验要求进行准备。通常需要将 PEI 溶解在适当的缓冲液中，调整其 pH 值至合适范围。

• siRNA 与聚合物混合：将 siRNA 稀释在适当的缓冲液中，然后将其与聚合物溶液按照一定的比例混合，轻轻搅拌，使 siRNA 与聚合物充分结合形成聚合物 - siRNA 复合物。在混合过程中，需要注意控制溶液的离子强度和 pH 值，以确保复合物的稳定性和转染效率。

• 细胞培养：将细胞接种在培养皿或培养板中，培养至合适的细胞密度。

• 转染操作：将聚合物 - siRNA 复合物缓慢加入到细胞培养液中，轻轻摇匀，使复合物与细胞充分接触。然后将细胞在适宜的条件下培养，观察 siRNA 的转染效果和基因沉默情况。

3. 优点

• 具有较高的转染效率，尤其是对于一些难以转染的细胞类型，如神经细胞等，表现出较好的效果。

• 聚合物材料相对便宜，成本较低。

• 可以通过对聚合物进行化学修饰来改善其转染性能和生物相容性。

4. 缺点

• 聚合物可能对细胞具有一定的毒性，需要优化聚合物的用量和转染条件，以降低细胞毒性。

• 转染过程中可能会受到细胞内溶酶体的降解作用，影响 siRNA 的释放和基因沉默效果，需要采取一些措施来提高 siRNA 的稳定性和逃逸溶酶体降解的能力。

四、siRNA 转染的生物方法

（一）病毒载体介导法

1. 原理：病毒载体介导法是利用病毒具有感染细胞并将其遗传物质导入细胞内的特性，将 siRNA 克隆到病毒载体中，然后通过病毒感染细胞的方式将 siRNA 带入细胞内，实现基因沉默。常用的病毒载体包括腺病毒载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体等。

2. 操作步骤

• 病毒载体构建：选择合适的病毒载体系统，并将设计好的 siRNA 序列克隆到病毒载体中。构建过程需要涉及到分子克隆技术，包括酶切、连接、转化等步骤，以确保 siRNA 正确插入到病毒载体的基因组中。

• 病毒包装：将构建好的病毒载体质粒与包装质粒共同转染到包装细胞中，如 293T 细胞等。在包装细胞中，病毒载体的基因组会被包装成具有感染性的病毒颗粒。

• 病毒纯化：收集包装细胞培养上清中的病毒颗粒，通过离心、过滤等方法进行纯化，去除杂质和未包装的病毒成分，以获得高纯度的病毒悬液。

• 细胞感染：将纯化后的病毒悬液感染目标细胞。在感染过程中，需要根据病毒的特性和细胞类型选择合适的感染复数（MOI），以确保病毒能够有效地感染细胞并将 siRNA 导入细胞内。感染后的细胞在适宜的条件下培养，观察基因沉默效果。

3. 优点

• 转染效率高，能够实现长期稳定的基因沉默，尤其适用于需要长期观察基因功能的实验。

• 可以感染多种类型的细胞，包括分裂细胞和非分裂细胞。

• 病毒载体可以携带较大的基因片段，便于同时导入多个 siRNA 或其他基因元件，进行复杂的基因调控实验。

4. 缺点

• 病毒载体的构建和包装过程相对复杂，需要一定的技术和设备支持。

• 病毒载体可能具有潜在的免疫原性和生物安全性风险，在使用过程中需要严格评估和控制。

• 病毒载体的应用受到法律法规的严格限制，需要遵守相关的规定和审批程序。

（二）细菌载体介导法

1. 原理：细菌载体介导法是利用一些经过改造的细菌作为载体，将 siRNA 传递到细胞内。例如，利用减毒的沙门氏菌或大肠杆菌等细菌，将携带 siRNA 的表达质粒导入细菌内，然后通过细菌感染细胞的方式将 siRNA 传递到细胞中。在细胞内，siRNA 可以从表达质粒中转录出来，发挥基因沉默作用。

2. 操作步骤

• 细菌载体构建：将含有 siRNA 表达元件的质粒转化到合适的细菌菌株中，如减毒的沙门氏菌或大肠杆菌。构建过程需要确保质粒在细菌内能够稳定存在和表达。

• 细菌培养：将转化后的细菌在适宜的培养基中培养，使其生长至合适的浓度。

• 细胞感染：将培养好的细菌与目标细胞共培养，或者通过注射等方式将细菌导入体内，使其感染细胞。在感染过程中，细菌会将携带的 siRNA 传递到细胞内。

• 后续观察：感染后的细胞在适宜的条件下培养，观察 siRNARNA 的转染效果和基因沉默情况。同时，需要监测细菌在体内的分布和存活情况，以及对机体的潜在影响。

3. 优点

• 细菌载体具有较强的侵袭能力，能够有效地将 siRNA 传递到细胞内，尤其是对于一些体内实验，具有一定的优势。

• 细菌载体的制备相对简单，成本较低。

• 可以通过口服等方式给药，具有一定的便利性。

4. 缺点

• 细菌可能会引起机体的免疫反应，影响转染效果和实验结果，需要对细菌进行适当的减毒和免疫调节处理。

• 细菌载体在细胞内的释放和 siRNA 的表达调控相对复杂，需要进一步优化和研究。

• 细菌载体的应用范围相对较窄，目前主要集中在一些特定的疾病模型和体内实验中。

五、结论