siRNA转染实验的关键点

一、引言

二、实验材料的选择与准备

（一）siRNA 的设计与合成

1. 序列设计：siRNA 的序列设计是实验成功的基础。应遵循一定的原则，如选择靶基因的保守区域，避免非特异性结合位点；同时，要考虑 siRNA 的二级结构和热力学稳定性，以提高其沉默效率。目前，有多种在线设计工具可供使用，但仍需结合实验目的和细胞类型进行优化。

2. 合成方法：化学合成是常用的 siRNA 合成方法，具有纯度高、准确性好的优点。此外，还可以通过体外转录或基于载体的表达系统来制备 siRNA。不同的合成方法各有优缺点，需要根据实验需求和预算进行选择。

（二）转染试剂的选择

1. 阳离子脂质体转染试剂：具有较高的转染效率，能够与 siRNA 形成复合物，通过与细胞膜的相互作用进入细胞。但其细胞毒性相对较大，可能会影响细胞的正常生理功能。

2. 阳离子聚合物转染试剂：如聚乙烯亚胺（PEI），能够有效地压缩 siRNA 并促进其细胞内摄取。其转染效率较高，且细胞毒性相对较低。然而，PEI 的分子量和电荷密度等因素会影响其转染性能，需要进行优化选择。

3. 病毒载体转染试剂：如腺病毒、慢病毒等，能够高效地将 siRNA 导入细胞，并且可以实现长期稳定的基因沉默。但病毒载体的制备过程较为复杂，且存在一定的安全风险，需要在严格的生物安全条件下操作。

（三）细胞的培养与准备

1. 细胞类型的选择：不同的细胞类型对 siRNA 转染的敏感性和耐受性存在差异。因此，在实验前应根据研究目的选择合适的细胞系或原代细胞。同时，要了解细胞的生长特性和培养条件，确保细胞处于良好的生长状态。

2. 细胞培养条件：细胞应在适宜的培养基、温度、湿度和二氧化碳浓度下培养。在转染实验前，要确保细胞达到合适的密度，一般为 60% - 80% 汇合度，以保证转染效率和细胞活性。

三、转染方法的选择与优化

（一）脂质体转染法

1. 操作步骤：将适量的 siRNA 和脂质体转染试剂分别稀释于无血清培养基中，然后将两者混合，室温孵育一定时间，形成 siRNA - 脂质体复合物。将复合物加入到细胞培养液中，轻轻摇匀，继续培养一定时间后，更换为含血清的培养基。

2. 影响因素：脂质体与 siRNA 的比例、孵育时间和温度、细胞密度等都会影响转染效率。一般来说，需要通过预实验来确定最佳的转染条件。此外，血清中的蛋白质可能会与脂质体复合物结合，降低转染效率，因此在转染过程中通常使用无血清培养基。

（二）电穿孔转染法

1. 操作步骤：将细胞悬浮于适当的电穿孔缓冲液中，加入 siRNA，然后将细胞悬液转移至电穿孔杯中。设置合适的电穿孔参数（如电压、脉冲时间、脉冲次数等），进行电穿孔操作。电穿孔后，将细胞转移至培养皿中，加入培养基进行培养。

2. 影响因素：电穿孔参数的选择是关键，过高的电压和过长的脉冲时间可能会导致细胞死亡，而过低的参数则会降低转染效率。此外，细胞类型、细胞密度、siRNA 的浓度等也会对转染效果产生影响。在实验过程中，需要针对不同的细胞和实验条件进行优化。

（三）病毒载体转染法

1. 操作步骤：对于腺病毒载体，首先需要在合适的细胞系中扩增和纯化病毒。然后将病毒以适当的感染复数（MOI）加入到细胞培养液中，感染一定时间后，更换为新鲜的培养基。对于慢病毒载体，需要将病毒与细胞在含有聚凝胺等增强感染试剂的条件下共培养，然后进行筛选和培养。

2. 影响因素：病毒载体的滴度、感染复数、感染时间以及细胞的状态等都会影响转染效率和基因沉默效果。在使用病毒载体时，要注意病毒的保存和使用条件，避免病毒失活。同时，要对感染后的细胞进行筛选和鉴定，以获得稳定表达 siRNA 的细胞株。

四、实验条件的优化

（一）siRNA 浓度的优化

（二）转染时间的优化

（三）培养条件的优化

五、转染效果的评估

（一）基因沉默效果的检测

1. RT - PCR 检测：通过提取细胞总 RNA，反转录为 cDNA，然后利用特异性引物进行 PCR 扩增，检测靶基因 mRNA 的表达水平。基因沉默效果通常以相对于对照组的 mRNA 表达抑制率来表示。

2. Western blot 检测：提取细胞总蛋白，利用特异性抗体进行 Western blot 分析，检测靶蛋白的表达水平。通过比较转染组和对照组中靶蛋白的灰度值，来评估基因沉默效果。

3. 荧光素酶报告基因检测：如果靶基因的下游调控区含有荧光素酶报告基因，可以将其与 siRNA 共转染到细胞中，通过检测荧光素酶的活性来间接反映靶基因的表达水平和沉默效果。

（二）转染效率的检测

1. 荧光标记 siRNA：可以使用荧光标记的 siRNA 进行转染，然后在荧光显微镜下观察细胞内荧光的分布情况，计算荧光阳性细胞的比例，以评估转染效率。

2. 流式细胞术检测：通过流式细胞仪检测荧光标记的 siRNA 或转染试剂与细胞结合的情况，从而准确地测定转染效率。同时，还可以分析细胞的活性和凋亡情况，评估转染对细胞的影响。

（三）细胞毒性的评估

1. MTT 法：将细胞接种于 96 孔板中，进行 siRNA 转染后，加入 MTT 溶液，继续培养一定时间。然后去除培养液，加入 DMSO 溶解甲瓒结晶，通过酶标仪测定吸光度值，计算细胞存活率，以评估细胞毒性。

2. LDH 释放法：检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）的活性，LDH 是一种细胞内酶，当细胞受损时会释放到培养液中。通过比较转染组和对照组中 LDH 的活性，来评估细胞毒性。

六、结论