干货 | T4 RNA Ligase 2：结构机理应用全解析

在分子生物学的精密实验体系中，酶分子犹如高度特化的"分子手术刀"，以其卓越的催化特异性和反应效率，精准调控着核酸操作、蛋白修饰等核心生物学过程，为现代分子生物学研究提供了不可或缺的技术支撑。该酶兼具RNA链分子间与分子内连接活性，既能精准连接双链RNA中的切刻位点，又可实现双链结构中RNA 3′羟基与DNA 5′磷酸基的切刻连接。与同家族的T4 RNA Ligase 1相比，其对双链RNA切刻的连接活性显著高于单链RNA末端连接，成为双链RNA切刻连接研究的核心工具。

图1. T4 RNA Ligase 2作用底物示意图

T4 RNA Ligase 2由噬菌体T4的24.1基因编码，分子量约37 kDa，隶属于ATP依赖型连接酶家族。其分子结构包含 I、III、IIIa、IV、V等多个高度保守的功能域，这些功能域通过精密的空间排布形成稳定的核苷酸结合口袋，为催化反应提供了高效的结构基础。更为关键的是，Glu-34、Arg-55、Lys-209等关键氨基酸在活性中心的精准定位，使其在RNA与DNA的连接反应中同时具备高催化活性与底物特异性，确保反应的精准高效进行。^[1]

图2. T4 RNA Ligase 2结构图^[2]

T4 RNA Ligase 2 通过三步有序的催化反应实现相邻核苷酸的连接，其作用机理体现了分子层面的精准调控：

①连接酶与ATP反应形成酶-AMP复合中间体；

② AMP脱离酶-AMP复合体，与RNA的5’-磷酸结合，形成5’端腺苷化的RNA；

③ 5’端腺苷化的RNA与3’-OH连接形成磷酸二酯键，释放AMP。

图3. T4 RNA Ligase 2催化作用机理图^[3]

基于T4 RNA Ligase 2的核心结构与作用机理，翌圣生物通过优化表达体系与纯化工艺，成功研发出高性能的T4 RNA Ligase 2（Cat#14652）。该产品在保留酶天然催化活性的同时，通过多步纯化工艺剔除杂酶干扰，为科研人员提供稳定可靠的实验工具。以下将从连接活性与纯度控制两个核心维度，展示其关键性能指标。

将Yeasen和进口Supplier N*的T4 RNA Ligase 2按照不同投入量加入体系中对dsRNA底物进行连接，结果显示其能有效连接dsRNA底物，连接效果与进口Supplier N*相当。

图4. T4 RNA Ligase 2连接效果验证

注：20 μL反应体系中包含终浓度为20 μM的dsRNA连接底物。

将100 U T4 RNA Ligase 2分别与核酸底物一起孵育，琼脂糖凝胶电泳比较谱带变化。结果显示翌圣3个批次的T4 RNA Ligase 2均无核酸外切酶、切口酶、RNase残留，彻底消除了非特异性酶活性对实验的干扰风险。

图5. T4 RNA Ligase 2核酸外切酶、切口酶、RNase残留检测结果

参考文献：

[1] Yin S, Ho C K, Shuman S. Structure-function analysis of T4 RNA ligase 2[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(20): 17601-17608.

[2] Easey A. Synthetic Biology Methods to Optimise T4 RNA Ligase Activities[D]. University of East Anglia, 2018.

[3] Viollet S, Fuchs R T, Munafo D B, et al. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis[J]. BMC biotechnology, 2011, 11: 1-14.