文献｜伪亲和层析：离子交换的特殊用法
伪亲和层析
亲和层析能特异性捕获目标分子，然后改变条件洗脱从而实现分离。伪亲和层析与此类似，但基于分子间非特异性相互作用（如氢键、疏水相互作用或静电作用等）。这种相互作用亲和力适中，通过改变条件干扰结合相互作用即可实现洗脱。伪亲和特别适合没有特异性配体的纯化场景，下面一起来看看伪亲和层析的案例：
目前大多数血制品企业仍使用低温乙醇沉淀后衔接层析步骤，用于获得高纯度的血浆制品。高载量、高收率和低成本使得阴离子交换层析广泛应用于血浆蛋白分离。FVIII（凝血八因子）和PCC（凝血酶原复合物）若不经冷沉淀处理直接上柱均会被牢固吸附，NaCl梯度无法实现分离。这时候常需要一步金属螯合层析来分离FVIII和PCC蛋白，费时费力。
研究者将伪亲和概念引入离子交换层析：当维生素K依赖的蛋白与Ca2+结合时构象会变化，继而减少负电荷暴露，减弱电荷吸引则在较低的盐浓度被洗脱。基于这一现象，文献已报导纯化rFII、rFIX、rPC和rPS的案例。
实验方法
Q Sepharose FF (CV=46 mL)
上样15 mL/min，其他25 mL/min；
线性洗脱：10 CV，从5 mM升至100 mM CaCl2（洗脱液B）；缓冲液C（25 mM柠檬酸钠，500 mM NaCl和5 mM CaCl2，pH 6.0）再淋洗后1 M NaOH碱洗保存；
步级洗脱方式：平衡上样后改步级梯度，则分别设成5 CV的15 mM CaCl2和65 mM CaCl2的洗脱液，C洗涤后清洗和保存。
ANX Sepharose FF (CV=48 mL)
流速与前一致；
使用柠檬酸缓冲液线性洗脱：上样后10 CV的5 mM升至25 mM CaCl2（洗脱液B），缓冲液C淋洗后柱清洗；
使用Bis-tris或MES线性洗脱：比较Bis-tris (pKa 6.46) 和MES (pKa 6.15) 的纯化效果；
步级梯度方式：5 CV的25 mM CaCl2或10 mM CaCI2淋洗后再用5 CV的25 mM CaCl2。
DEAE Sepharose FF (CV=18 mL)
流速与前一致；
线性梯度使用Ca2+ 5 mM升至50 mM。在线性梯度之后用缓冲液D（25 mM柠檬酸钠，NaCl 400 mM和5 mM CaCl2，pH 6.0）洗脱。再生清洗步骤一致
实验结果
5-100 mM Ca2+梯度洗脱的结果显示，随着Ca2+的增加，两个峰被洗脱出来，而将NaCl增加到500 mM时，却没有观察到峰出现。活性曲线结果表明，FIX在“F3-6”组分（即5.4至17.9 mM CaCl2）之间洗脱，而FVIII则在“F6-13”（即17.9至63.6 mM CaCl2）之间被洗脱。基于此，建立了分别用15和65 mM CaCl2进行两级梯度洗脱的方案并成功实现了FIX与FVIII的分离：15 mM CaCl2回收的FIX活性为86%；而在含65 mM CaCl2缓冲液中的FVIII活性为60%。
图1：用15和65 mM CaCl2梯度纯化Q Sepharose FF上的血浆的色谱图（左）；7.5% SDS-PAGE结果（右）
表1：血浆中纯化FVIII的活性
# 比活性计算：每毫升活性 (U/ mL) 除以每毫升蛋白质浓度 (mg/mL) 。* 65 mM CaCl2组份中的FVIII活性。
研究者比较了不同离子交换填料（Q、ANX和DEAE Sepharose FF）的纯化效果，通过控制柠檬酸缓冲液中CaCl2和NaCl的浓度，最终都能建立洗脱程序实现FVIII和PCC的分离。具抗凝活性的柠檬酸缓冲液常用于FVIII的纯化，但它能螯合Ca2+离子，因此选择Bis-tris和MES缓冲体系进行类似的实验。有趣的是，后两种缓冲体系没能实现FVIII和PCC的有效分离，反而是与钙离子有相互作用的柠檬酸缓冲液更有利于FIX的洗脱。与传统的Cohn方法相比，使用此法无需冷冻沉淀就能获得富集的FVIII部分，因此可大大减少工艺时间和成本。
伪亲和色谱法的原理是利用对目标分子具有亲和力的固定配体与目标分子本身之间的可逆结合相互作用，由于较弱的相互作用，如氢键、疏水相互作用或静电力等，在温和的条件下即能够实现高效的分离纯化。那些难以通过特异性亲和色谱法分离的分子，或者当特异性配体难以获得时，通过这种方法可以有效的提升纯度，达到意想不到的效果。
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参考文献：
Non-Cryoprecipitation Separation of Coagulation FVIII and Prothrombin Complex Proteins by Pseudoaffinity Calcium Elution Chromatography Using Anion Exchange Resin - PMC (nih.gov)
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