Protein Select填料是一种用于重组蛋白纯化的亲和层析填料，其最主要特点是通过标签自裂解的方式实现目标蛋白的纯化，在洗脱过程中实现目的蛋白收获和标签去除的双重目标（图1）。
图1：Protein Select填料纯化重组蛋白步骤示意图
相较于其它亲和标签纯化如组氨酸标签蛋白纯化、GST标签蛋白纯化和MBP标签蛋白纯化等纯化过程省去了标签去除步骤，提高了蛋白纯化效率。
亲和层析填料Protein Select
主要特点：
1
适用面广，适用于不同类型重组蛋白纯化；
2
纯化过程简单，一步即可完成蛋白纯化和标签去除；
3
蛋白纯度高，使用Protein Select填料可以获得高纯度不含有标签的重组蛋白；
4
操作条件温和，使用单一溶液（pH 6-9），避免造成蛋白聚集和生物活性降低的现象；
5
适用于不同表达系统，包括常用的大肠杆菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
Protein Select纯化重组蛋白尽管具有以上的多种优势，但作为创新型重组蛋白纯化系统，填料的相关优化使用技巧需要进一步的积累和验证。
本文介绍法国巴斯德研究所（Institut Pasteur）研究人员使用Protein Select填料的使用实例及经验总结，希望对Protein Select填料的使用和优化提供参考，推动Protein Select填料应用的推广和普及。
实验目标
使用Protein Select填料纯化大肠杆菌（E. coli）系统表达的重组绿色荧光蛋白（GFP），利用GFP荧光更加直观的观察蛋白与填料结合与洗脱过程。
研究不同纯化温度对Protein Select标签自剪切速率的影响；Protein Select使用说明中提到目的蛋白N端前三位氨基酸性质影响Protein Select自剪切速率（表1）。
研究人员在重组GFP蛋白中验证了N端前三位氨基酸性质变化对于Protein Select标签自剪切速率的影响。
表1：目的蛋白前三位氨基酸性质
对Protein Select标签自剪切速率的影响
实验步骤与结果
重组GFP蛋白获取过程从质粒构建开始（目的蛋白N端添加Protein Select标签），然后是蛋白表达，最后进行标签蛋白纯化。
1. 质粒构建
为了提高重组蛋白的表达，研究人员对Protein Select tag的密码子进行了优化处理，以达到最小化RNA二级结构的自由能同时增加mRNA翻译起始位点可及性的目的（图2）。
图2：优化前后Protein Select tag的RNA二级结构对比
依据填料使用说明中给出的目的蛋白N端前三位氨基酸性质对Protein Select标签自剪切速率的影响，分别构建N端前3位氨基酸性质不同的3个质粒GFP#1、GFP#2和GFP#3（图3）。
图3：N端前3位氨基酸性质不同的3个GFP质粒
2. 蛋白表达
重组GFP蛋白表达体积10 ml，培养温度30°C，搅拌速度180 rpm，过夜培养。
最终通过荧光定量的方法10 ml表达体积，获得GFP蛋白大约12 mg；另外研究发现含有Protein select标签GFP蛋白与没有标签GFP蛋白相比，蛋白表达量基本没太大变化（图4）。
图4：Protein Select标签对GFP蛋白表达量结果
3. Protein Select标签蛋白纯化
3.1温度对Protein Select标签自剪切速率的影响
温度对Protein Select标签自剪切速率的影响，实验采用GFP#1质粒在4°C和室温进行对比实验。
比较两种条件下孵育4个小时蛋白收获量（量度标签自剪切速率）和两种温度条件下总蛋白收获量（间隔4小时收集一次，共进行4次收集）。
实验结果表明室温条件较4°C条件Protein Select标签自剪切速率明显提高，而且总蛋白收获量也明显提高（表2）。
表2：4°C和室温条件下
孵育4个小时蛋白收获量和两种温度条件下总蛋白收获量
3.2目的蛋白N端前3位氨基酸性质对Protein Select标签自剪切速率的影响
为了研究目的蛋白N端前3位氨基酸性质对Protein Select标签自剪切速率的影响，研究人员构建质粒GFP#1、GFP#2和GFP#3（图3）。
分别使用3个质粒进行表达和蛋白纯化（室温条件），比较孵育4个小时蛋白收获量（量度标签自剪切速率）和总蛋白收获量（间隔4小时收集一次，共进行4次收集）（表3）。
从Protein Select标签自剪切速率角度看，GFP#2与GFP#1相比目的蛋白N端第二位增加一个芳香族氨基酸苯丙氨酸（F），其孵育4个小时蛋白收获量显著多于GFP#1孵育4个小时蛋白收获量，表明GFP#2的标签自剪切效率明显高于GFP#1。
GFP#3与GFP#2相比保留了目的蛋白N端第二位苯丙氨酸（F），但是N端第一位氨基酸替换成丙氨酸（A）同时N端第三位增加一个缬氨酸（V），实验结果表明GFP#3标签自剪切速率快于GFP#2，更是明显快于GFP#1标签自剪切速率（表3）。
表3：室温条件3种质粒表达GFP蛋白
孵育4个小时蛋白收获量和总蛋白收获量
总结
以上实验结果来自Institut Pasteur，研究人员最后总结了 Protein Select填料应用的相关优势及使用过程中需要注意的问题。
优势：
1
Protein select标签的添加不会影响重组蛋白表达量。
2
Protein Select填料与Protein select标签结合效率高。
3
纯化系统简单，纯化过程中只使用单一溶液。
4
收获蛋白纯度高，标签自剪切后不会有氨基酸残留。
5
Protein Select填料可以清洁，多次重复使用。
使用过程中需要注意的问题：
1
目的蛋白N端前三位氨基酸会对标签自剪切速率产生较大影响，在质粒构建时需要依据Protein select 使用说明中相关建议对N端前三位氨基酸进行优化以提高标签的自剪切速率。
2
纯化过程中实验温度对Protein select 标签自剪切速率影响较大，进而影响总蛋白收获量。
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参考文献：
1. Protein Select resin Datafile
2. Protein Select resin Instructions for Use 29711002 AB
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