亲和层析是利用填料配基与目标分子间特异性相互作用，将不结合的杂质冲洗去除，再洗脱得到目标分子。亲和层析高选择性的特点，决定了其多用于纯化过程中的捕获阶段。亲和层析是蛋白下游纯化捕获的首选方法，但是实践中许多蛋白缺乏可用的亲和捕获模式；为了解决这个问题，通过在目的蛋白上添加亲和标签，使得目的蛋白可以使用亲和层析的方法进行捕获[1]。
目前使用最为广泛的亲和标签是组氨酸标签，此外还包括GST标签、Strep标签和MBP标签等。这些标签有一个共同的特点是亲和捕获后仍然保留在目的蛋白上，而研究表明这些额外添加的标签会一定程度的影响目的蛋白的生物活性，并且有增加蛋白免疫原性的潜在风险，这也就限制了添加标签的重组蛋白在商业生产中的使用[2,3]。
为了去除目的蛋白的亲和标签，一系列方法被开发出来；主要就是通过化学或者酶解方式达到去除亲和标签的目的，但化学方法的条件较为严苛容易导致蛋白变性，酶解方法条件温和却存在成本较高的问题[4,5]。本文介绍R. Clifford等人使用具有自剪切能力 Protein Select填料纯化标签蛋白（图1），并研究了该系统中亲和标签蛋白溶解度、结合载量、裂解动力学和填料清洁等多方面内容[6]。
图1：适用于生产重组蛋白的具有自剪切能力 Protein Select系统概述（Nc-intein指标签N端）
01
研究材料与设备
文中蛋白表达使用到细菌E. coli BL21 (DE3) 表达系统、哺乳动物细胞CHO细胞和293细胞表达系统。纯化填料使用 Protein Select、Ni Sepharose excel、HiLoad 16/600 Superdex 75 prep grade column、IMAC填料、Capto Phenyl ImpRes和Capto Q，均来自于。蛋白纯化中使用 ?KTA Avant蛋白纯化系统，动力学实验使用Biacore T200设备，均来自。
02
实验结果
结合与剪切动力实验
结合与剪切动力实验中使用了3种在目的蛋白N端添加亲和标签 (Cc-intein) 的重组蛋白：分别为Cc-intein-IL-1b-His6（P2F，目的蛋白第二位氨基酸P突变为F），Cc-intein-IFNAR-1 ECD-His6（分子量大于Cc-intein-IL-1b-His6）和Cc-intein-IFNAR-1 ECD-His6 (AFV)（目的蛋白N端添加AFV三个氨基酸）。实验中标签N端固定于CM5芯片表面，分别测定以上3种蛋白的动力学参数（图2），50次重复使用后Cc-intein与配基仍然保持较高结合与切割活性（图2. A），同时发现目的蛋白分子量会一定程度影响标签切割效率（分子量大相对效率低一点）但目的蛋白前3位的氨基酸序列对切割效率影响更为明显（图2. B）。
图2：Cc-intein标签蛋白动力学实验结果
填料性能研究
可放大性研究实验，使用Protein Select填料在1 ml和20 ml填料体积条件下分别纯化Cc-intein-BiTE-His6 (AFV) 和Cc-intein-SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) ，图3. A、C为使用1 ml层析柱蛋白纯化图谱，B、D为HPSEC分析图谱；图3. E、G为使用20 ml层析柱蛋白纯化图谱，F、H为HPSEC分析图谱。洗脱液质量结果分析也非常接近，表明不同规模层析柱条件下，纯化结果高度一致，说明Protein Select填料具有可靠的放大性。
图3：不同柱体积纯化标签蛋白纯化及HPSEC分析图谱
Protein Select填料纯化蛋白质量分析
亲和层析后Cc-intein-BiTE-His6 (AFV) 和Cc-intein-SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) 通过进一步精纯去除蛋白聚体，获得蛋白单体。使用质谱分析的方法对蛋白单体进行分析以确定标签切除的准确性。质谱结果表明纯化获得的蛋白单体分子量与没有标签蛋白分子量完全相同，说明目的蛋白的Cc-intein标签被准确的完全切除（图4）。
图4：标签切除后BiTE-His6 (AFV) 和SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) 分子量质谱分析结果
Protein Select填料纯化蛋白活性分析
为了进一步评估Protein Select填料纯化蛋白活性，作者使用IMAC填料纯化的BiTE-His6 (AFV) 和SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) 作为对照样品。使用两种填料纯化的SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) ，分别测定该蛋白与CR3022和2094-TM-YTE结合动力学参数（图5），实验结果说明两种方法纯化的SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) 与抗体CR3022和2094-TM-YTE都表现出很高的亲合力。
图5：SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) 结合动力学结果（A和B分别显示由Protein Select填料和IMAC填料纯化得到SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) 与抗体CR3022结合动力学结果。C和D分别显示由Protein Select填料和IMAC填料纯化得到SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) 与抗体2094-TM-YTE的结合动力学结果）
使用两种层析填料纯化的BiTE-His6 (AFV) 蛋白的生物学活性进行了测定，发现两种填料纯化得到蛋白没有显著的生物活性差异，在结合动力学、细胞毒性和T细胞激活能力方面表现都基本相同（图6）。
图6：BiTE-His6 (AFV) 活性测试结果（A. BiTE-His6 (AFV) 对SW620细胞系细胞裂解能力，B. BiTE-His6 (AFV) 对MDA-MBA-231细胞系细胞裂解能力, C. BiTE-His6 (AFV) 对 SW620细胞系进行CD4+T细胞活化，D. BiTE-His6 (AFV) 对MDA-MBA-231细胞系 CD4+T细胞活化，E. BiTE-His6 (AFV) 对SW620细胞系激活CD8+T细胞，F. BiTE-His6 (AFV) 对MDA-MBA-231细胞系CD8+T细胞活化）
Protein Select填料与IMAC纯化蛋白质量对比
为了进一步将Protein Select蛋白纯化系统与其它亲和系统进行比较，作者使用Protein Select填料和IMAC填料分别纯化Cc-intein-BiTE-His6 (AFV) 蛋白，上样体积200 ml，层析柱体积为1 ml。结果表明两种填料纯化蛋白质量相似但蛋白收获量差异较大。表1展示两种填料纯化Cc-intein-BiTE-His6 (AFV) 蛋白收获量、洗脱液中单体、聚体比例。
表1：Protein Select填料和IMAC填料纯分别纯化Cc-intein-BiTE-His6 (AFV) 蛋白质量结果
以细胞收获液为样品的实验中，Protein Select填料蛋白收率与IMAC填料蛋白收率存在差异。为了解释这种差异的原因，作者使用：
IMAC填料以细胞收获液和Protein Select填料纯化流穿液为样品纯化Cc-intein-BiTE-His6 (AFV) 和Cc-intein-SARS-CoV-2 spike RBD-His6 (AFV) ，实验结果蛋白收获量、洗脱液中单体、聚体比例见表2。从蛋白收获量上看使用IMAC填料以细胞收获液为原料两种蛋白收获量分别为8.7 mg和13.0 mg；
而使用Protein Select填料纯化流穿液为原料的实验组蛋白收获量分别为4.3 mg和9.1 mg这部分蛋白收获量加上之间使用Protein Select填料的蛋白收获量非常接近IMAC填料以细胞收获液得到的蛋白收获量。
这个结果说明相同体积条件下IMAC填料蛋白结合量高于Protein Select填料。IMAC填料蛋白纯化图谱见图7。
表2：IMAC填料纯化Cc-intein-BiTE-His6 (AFV) 和Cc-intein-SARS-CoV-2 spike RBD-His6 (AFV) 蛋白质量结果
图7：IMAC纯化BiTE和SARS-CoV-2 spike protein RBD图谱（A、B为BiTE和SARS-CoV-2 spike protein RBD纯化图谱，样品为细胞收获液；C、D为BiTE和SARS-CoV-2 spike protein RBD纯化图谱，样品为Protein Select纯化流穿液）
Cc-intein标签稳定性研究
Protein Select填料与IMAC填料相比蛋白结合量较低，推测可能是亲和标签与Protein Select填料配基结合方面造成，为了研究这个问题作者对两种填料洗脱液进行质谱分析。研究发现Protein Select填料洗脱液只包含切除标签目的蛋白，但IMAC填料洗脱液为含有全长Cc-标签或截短Cc-标签的蛋白质混合蛋白，而截短Cc-标签是不能与Protein Select填料配基结合的，这就解释了Protein Select填料与IMAC填料相比蛋白结合量较低的问题。
表3：Protein Select填料与IMAC填料纯化Cc -intein-BiTE-His6 (AFV) 洗脱液质谱结果
表4：Protein Select填料与IMAC填料纯化Cc-intein-SARS-CoV-2 spike protein RBD-His6 (AFV) 洗脱液质谱结果
为了进一步验证验证Cc-intein标签如果保存不当造成降解，将影响蛋白结合到填料Protein Select填料上的假设，作者对不同保存条件的Cc-intein-BiTE-His6 (AFV) 样品，使用IMAC填料纯化收集洗脱液样品进行质谱分析。质谱分析结果见表5，其中Day0对照样品中目标蛋白+full-length tag的比例占33.1%大约为样品总量1/3，这个数据刚好与表1中Protein Select填料蛋白收获量 (10.2 mg) 占IMAC蛋白收获量 (29.8 mg) 1/3相一致，这一结果说明了Protein Select填料可以实现大于10 g/L的蛋白载量，对样品中目标蛋白+full-length tag的蛋白其收率接近100%。
表5：IMAC蠢货不同保存条件下Cc-intein-BiTE-His6 (AFV) 样品质谱分析结果
总 结
以上研究使用 Protein Select填料进行亲和标签蛋白纯化，发现该填料具有以下特点：
1
该填料可以实现目的蛋白捕获和标签去除在同一层析步骤中完成。
2
该填料蛋白载量大于10 g/L而且经过多达50次再生和清洁，仍然可以维持蛋白载量相对稳定。
3
该填料具有良好的放大性，可以满足从实验室研究到生产各种不同规模的使用要求，而且在细菌和哺乳动物表达系统都可以适用。
最后需要说明的是目的蛋白前三位氨基酸序列会对标签切割效率产生重要影响，接近标签位置的脯氨酸需要进行突变以减少对标签切割效率的影响。表6列出目的蛋白前三位氨基酸性质对Protein Select剪切效率的影响。
表6：目的蛋白前三位氨基酸性质及其对Protein Select剪切效率的影响
为了获得更高蛋白收率细胞培养产物应该立即纯化或冷冻以备将来使用，而且研究表明相较于室温条件，细胞收获液在2-8 °C储存更有利于保持标签的完整性。
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