从源头到工艺：内毒素控制与去除全解析
引言：内毒素的威胁及其重要性
内毒素（Endotoxin）是革兰阴性菌外膜不可或缺的结构成分，是在细菌繁殖过程中以及菌体崩解、自溶时所释放出的毒性物质，其主要成分为脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。
在生物制品的生产过程中，内毒素是常见且严重的污染源。内毒素污染不仅会影响生物制品的纯度，还可能引发强烈的免疫反应，严重情况下甚至会导致患者出现发热、休克等不良反应。因此，在生物制品的生产工艺中，内毒素的去除和检测至关重要，是保障产品安全性的核心步骤。
Fig.1 内毒素结构示意图（图片引自Monteiro和Faciola，2020）
内毒素有单体、胶束或囊状的存在形式。内毒素以胶束、立方体、层状或囊泡形式聚集，在药物溶液中呈现净负电荷。带负电荷的“胶束”内毒素可以吸附在多聚阳离子配体上，或者可以通过疏水脂质尾部与疏水表面的相互作用去除单个内毒素单体。
Fig.2 内毒素存在形式
内毒素污染的主要来源
内毒素污染主要来自两大方面：
• 生产系统污染：在基因工程生产中，大肠杆菌常用于表达重组蛋白。在细胞破壁和纯化过程中，细菌内毒素会大量释放到溶液中，成为主要污染源。通常10%的湿菌浓度可产生几万EU/mL的内毒素。
• 原材料和环境污染：即便使用CHO细胞或酵母等不产生内毒素的表达系统，生产所用的原辅材料、溶液、生产环境以及操作过程中的污染，依然可能引入内毒素。
Fig.3 生产过程中内毒素污染控制
内毒素检测方法概述
为了保障生物制品的安全性，内毒素检测是必不可少的一环。常见的检测方法包括：
家兔热原法
本法仍收录在现行版《中国药典》中。由于家兔对热原的反应与人基本相似，所以采用家兔耳缘静脉注射的方式，监测家兔体温，用来定性检测热原。这种方法较为传统，但在敏感性和环保性方面有所限制。
鲎试剂（LAL）法
鲎试剂（LAL）法包括凝胶法和光度测定法，其中凝胶法包括凝胶限度试验和凝胶半定量试验两种，为《中国药典》规定的“仲裁”方法；光度测定法又分为浊度法（包括终点浊度法和动态浊度法）和显色基质法（包括终点显色法和动态显色法）。该方法利用鲎试剂中的凝胶酶与内毒素反应，被广泛用于检测。其具有操作简便、灵敏度高的优点。
重组C因子法
以重组技术生产C因子作为替代试剂，不仅能够有效检测内毒素，还避免了对自然资源（鲎蟹）的过度依赖，具有环保和可持续性的优势。
Fig.4 内毒素检测发展史
内毒素去除的主要层析工艺
如何有效去除生物制品中的内毒素成为生物制品安全性与质量保障的关键。内毒素的结构特征是去除细菌内毒素的基础，目前已形成多种内毒素去除层析工艺，包括疏水层析法、离子交换层析法、亲和层析法和凝胶过滤法等。
阴离子交换层析
利用内毒素在pH>2时带负电的特性，通过带正电荷的填料结合并去除。阴离子交换层析法适用于低盐浓度条件下的样品。可使用流穿模式，上样前将样品pH控制在目的蛋白pI以下，使其带正电。这样内毒素结合在填料上，目的蛋白直接流穿。
疏水层析
疏水层析法利用高盐增加蛋白疏水性与介质结合。在高盐体系中，内毒素由于脂质A部分有很强的疏水性发生凝集，无法与层析介质结合，因此能够有效去除内毒素。
凝胶过滤层析
内毒素可在水溶液中以非极性和离子相互作用，形成大小为1,000kDa 分子聚集体，它与多数生物蛋白分子量差异较大。基于这一特征，可以采用凝胶过滤层析，将大分子内毒素分子与目标蛋白分离。
亲和层析
使用特异性吸附内毒素的配基（如多粘菌素B），能够高效去除样品中的内毒素。
复合模式层析
结合电荷、疏水性和氢键等多种相互作用机制，复合模式填料能够在一步操作中高效去除内毒素，适用于要求高纯度的产品。
结语
内毒素的检测与去除是确保生物制品安全性和高质量生产的核心步骤。通过科学选择去除技术和高效的层析填料，不仅能有效降低内毒素含量，还能提升纯化效率，符合严格的国际法规标准。为应对内毒素去除的挑战，博格隆推出了一系列高效的层析产品，为生物制药行业提供可靠的解决方案，助力企业提升产品质量和效率。
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