做腺病毒总失败？包装关键步骤都在这了

做基因功能、疫苗、溶瘤病毒、细胞标记实验，腺病毒是真的好用 —— 表达强、快、不整合、滴度高。但很多人包装腺病毒都会踩坑：不长空斑、不病变、收不到毒、污染、滴度低。这篇整理了腺病毒包装超详细教程：，新手也能一次成功。

一、腺病毒包装系统

目前常用的腺病毒包装体系有 AdEasy 和 AdMAX 两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，然后再重组至腺病毒骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因 E1 和 E3 的缺陷 (ΔE1, ΔE3)，其中E3 基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装必需依赖表达 E1 的细胞系，例如 HEK-293 等。 维真生物采用的腺病毒包装系统包括了 AdEasy 和 AdMax 系统，其中 AdMax 系统操作简便、重组效率高、获得的病毒产率也高，是当前腺病毒包装主要采用的系统。

AdEasy 系统

AdMax 系统

二. 腺病毒包装流程 （以 AdMax 系统为例）

1. 目的载体制备

构建携带目的基因或靶点序列的 pADM 穿梭质粒。

2. 细胞转染

将上述目的质粒与腺病毒骨架质粒（pHelper） 共 转 染 HEK293细胞，进行 ORF 同源重组和腺病毒包装。

3. 毒种收获

转染后约 14 天进行出毒判定， 收集有 CPE（细胞病变）的细胞进行大量扩增。

4. 纯化浓缩

采用碘克沙醇密度梯度超速离心法对腺病毒进行纯化，浓缩后得到高滴度的腺病毒。

5. 滴度检测

去除游离 DNA 分子和病毒蛋白外壳后，采用QPCR 等方法对腺病毒进行滴度测定。

三、腺病毒（AdV）纯化

采用碘克沙醇密度梯度超速离心法对AdV病毒进行纯化。碘克沙醇是一种造影剂，已接受了临床检验。它具有非离子型、对细胞无毒和代谢惰性等优点。现在在病毒纯化方面应用广泛。它利用不同颗粒之间存在的沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。

四、腺病毒（AdV）滴度检测

AdV病毒采用多种方法来定量，主要包括QPCR法、孔稀释法和快速腺病毒滴度免疫检测法。