CRISPR/Cas13系统的作用机制是怎样的？

CRISPR/Cas13 系统是目前发现的能够靶向 RNA 的 CRISPR 系统，该系统的发现扩展了 CRISPR 系统在病毒干扰方面的应用。新发现的 Cas13 蛋白第四种亚型（Cas13d）的家族成员 CasRx 在体内外哺乳动物细胞的 RNA 裂解过程中显示出更强的特异性和更高的敲除效率，而且 CasRx 比之前发现的所有亚型都要小很多，更容易利用 AAV 载体实现体内递送，在 RNA 编辑方面具有很大的应用前景。目前， Cas13 家族共鉴定出四种亚型，包括 Cas13a（又名 C2c2）、Cas13b、Cas13c 和 Cas13d，四种Cas13 亚型蛋白分子量均小于 Cas9 蛋白。

CRISPR/Cas13 系统的防御机制主要包括以下几个阶段（以 Cas13a 为例）：

① pre-crRNA 的 识 别 与 结 合。

新转录的 pre-crRNA 通 过 crRNA 的 5’ 端 茎 环 结 构 与 Cas13a 的 REC 叶识别并结合，形成 pre-crRNA 与 Cas13a 复合物的中间过渡态；

② 成熟 crRNA 的形成。

NUC 区的 Helical-1 和 HEPN2 结构域之间保守残基的构象发生变化，从而形成一个酸碱催化中心，催化酶切 pre-crRNA 形成成熟的 crRNA。此时的crRNA-Cas13a 复合物处于无酶切活性状态；

③ crRNA-Cas13 复合物酶切活性的激活。

靶 ssRNA 进 入 crRNA-Cas13a 复 合 物 内 与crRNA 发生碱基互补配对，诱发 Cas13a 发生构象变化，从而激活 crRNA-Cas13a 复合物的酶切活性；

④ 靶 RNA 的 降 解。

在 crRNA 的 引 导 下， Cas13a 的 HEPN 结构域催化靶 ssRNA 的酶切。有时细菌细胞中会出现非特异性酶切的情况，导致细胞中其他附属 ssRNA 的降解，引起一定的细胞毒性，但这种现象在哺乳动物细胞中并未出现，其原因目前尚未可知。

CRISPR/Cas13a 系统作用机制示意图