CRISPR/Cas9系统的编辑原理是什么？

CRISPR是一种RNA诱导的获得性免疫系统，发现于细菌和古生菌中，用来抵抗外来病毒或是质粒的入侵。该系统由成簇间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences）和Cas基因（CRISPR-associated genes）组成。CRISPR/Cas系统分为两类：第1类包含I、III和IV型，使用多种Cas蛋白的复合体；第2类包含II、V和VI型，只使用一个具有多个结构域的Cas蛋白。第2类CRISPR/Cas系统具有简单、易使用性，更适合基因工程应用。

CRISPR/Cas 系统首先产生与靶标序列对应的RNA序列，与病毒或质粒的 DNA 进行互补作用，然后引导Cas 内切酶对互补的序列进行双链切割。其中Cas 基因家族中的Cas9广泛地应用于该系统中，它是一种天然存在的内切酶，具有两个酶切活性结构域 ：HNH核酸酶结构域和 Ruv-C like 结构域，分别切割互补链和非互补链。切割过程需要另外两个RNA的帮助，分别为CRISPR RNA（crRNA）和反式 CRISPR RNA（trans -acting CRISPR RNA，tracrRNA），人们已经将这两种RNA改造融合成一个向导RNA（single-guide RNA，sgRNA），单个sgRNA 足以帮助Cas9实现定点切割的效果。

CRISPR/Cas9系统的结构成分（Sun J et al. Brief Funct Genomics. 2020）

经过人工改造的 CRISPR/Cas9系统一般分为两种，一种主要由Cas9、tracrRNA 和 crRNA三部分构成 ；另一种主要由Cas9 和 sgRNA 两部分构成。载体的构建过程简便快捷，仅需人工合成一段和靶标序列相同的序列，连接至载体特定位点即可，具有高通量高效率的特点。