甜菊糖苷（SG）通常作为一种天然的无热量甜味剂用于食品和饮料。这类化合物具有相同的甜菊糖苷配基结构，但糖苷单元的数量和类型不同（例如葡萄糖、鼠李糖或木糖）。FAO/WHO JECFA专论26(2021)中收录了有关甜菊糖苷的新国际标准，其中推荐使用反相液相色谱法(RPLC)测定主要和次要甜菊糖苷。但是，采用JECFA推荐条件分析甜菊糖苷获得的色谱分离度并不理想（关键分析物对的分离度约为1.0）。Waters Arc? Premier基于高性能表面处理技术，使用2.5 μm粒径色谱柱，在获取更好分离度的同时建立了准确、灵敏、可靠且稳健的方法。
核心优势
根据ICH Q14《分析方法开发》指导原则中推荐的强化方法，对甜菊糖苷的LC-UV分离方法进行了系统优化；
使用具有MaxPeak高性能表面（HPS）技术的Arc Premier系统和色谱柱；
筛选了五款C18色谱柱，优化了洗脱条件，并评估了分析方法的性能；
关键分析物达到了更高的分离度，对复杂甜叶菊提取物的分析很有帮助。
实验详情
标准品和样品
JECFA方法中的13种主要SG和另外两种SG(即Reb I和Iso Reb A)。网购五种代表性的市售甜叶菊提取物。这些市售甜叶菊提取物的详细信息见表1。
图1. 本研究中使用的甜菊糖苷（SG）的结构。
表1. 本研究中使用的五种代表性市售甜叶菊提取物的信息。
标准品和样品溶液的制备
准确称取5 mg(精确至0.1 mg)标准品，用5 mL稀释剂（乙腈/水混合物，3/7 v/v）稀释，制得单标储备液。混标储备液制备方法如下：移取1.0 mL各单标储备液至20 mL玻璃样品瓶中，在温和的氮气流下挥干，然后用2 mL稀释剂复溶。用不同体积的稀释剂稀释混标储备液，制得浓度为5、20、50、100、200和500 μg/mL的六种工作标准溶液。
精确称取约100 mg样品溶于10 mL稀释剂中，分析前使用0.45 μm PTFE针式过滤器过滤。SG含量高的样品可能需要额外稀释。
方法条件如下：
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系统：配备2998 PDA检测器的Arc Premier系统（BSM）
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检测：UV(210 nm)和PDA(200~400 nm)
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软件：Empower? 3 CDS
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流动相A：乙腈/水（2:8 v:v，含0.02%甲酸）
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流动相B：含0.02%甲酸的乙腈
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柱温：45 ℃
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样品瓶：2 mL螺纹颈口玻璃样品瓶（P/N：186000273），带螺口盖（P/N：186000305）
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色谱柱：XSelect? Premier HSS T3 VanGuard? FIT色谱柱, 130 ?, 2.5 μm, 4.6 mm x 150 mm(P/N：186009863)
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进样体积：10.0 μL
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梯度洗脱程序：见表2
表2. XSelect? Premier HSS T3 VanGuard FIT色谱柱的梯度洗脱程序。
方法优化
和传统经验调节色谱条件，耗时的方法摸索不同，本方案应用实验设计软件（Fusion QbD软件）优化（单变量优化实验确定的）对分离度影响最大的三个梯度洗脱程序参数，即初始流动相组成、初始保持时间和第一个梯度洗脱的结束时间。
Fusion QbD软件应用流程：
基于关键影响因子设计样品序列导出至Empower 3 CDS运行数据处理后使用Fusion QbD检索，统计分析确定理想的色谱条件在不同水平下建立样品采样序列，稳定性测试。
结果与讨论
下表使用FAO/WHO JECFA专论26推荐的梯度洗脱程序筛选了五款色谱柱。XSelect Premier HSS T3色谱柱对关键分析物对（Reb A/SV）的分离度最高，因此后续实验优化基于该色谱柱进行。考察的条件包括柱温（30 ℃~45 ℃）、流速（0.7~1.0 mL/min）和梯度洗脱。采用单变量方案研究这些条件。在初步优化实验中，关键分析物对（Reb A/SV）的分离度达到了1.5。
表3. 本研究中筛选的色谱柱的详细信息。
梯度洗脱参数（例如洗脱时间和流动相组成）相互之间的依赖性很高，因此，我们采用多变量方案来微调梯度洗脱条件以获得理想的分离度。ICH Q14指导原则推荐采用多变量方案。微调洗脱条件后，关键分析物对的分离度达到了1.7。下图显示了四个相当有挑战性的分析物对在分离度至少达到1.70时的可接受性能区域。此外，我们还遵循ICH Q14指导原则，在接近理想液相色谱条件的条件下开展了稳定性测试。关键分析物对Reb A/SV的分离度至少达到了1.50，另外几个棘手的SG对（Reb O/Reb D、Reb E/Reb O和SV/Iso Reb A）的分离度至少达到了1.70。
图2. 初始流动相组成为5% B时，所得分离度至少达到1.70的可接受性能区域（空白区域）。Reb E/Reb D(显示为Reb D）、Reb D/Reb O(显示为将Reb O)、Reb A/SV(显示为SV)和SV/Iso Reb A(显示为Iso Reb A)这几个关键分析物对被设为优化目标。
图3. 稳定性测试结果。关键分析物对（Reb A/SV）的最低分离度为1.50，其他甜菊糖苷分析物对的最低分离度为1.70。表中的Reb O、Reb D、SV和Iso Reb A分别表示Reb E/Reb O、Reb O/Reb D、Reb A/SV和SV/Iso Reb A这几个分析物对。
表4. 稳定性测试中的液相色谱条件偏差范围和相关系统规格。
方法性能
峰纯度和谱库匹配
在Empower 3 CDS中创建PDA谱图库，用于存档每个标准样的UV/Vis谱图及其保留时间，根据保留时间和UV/Vis谱图来鉴定峰。此外，使用Empower的峰纯度功能确认峰未发生共洗脱。由于SG的UV/Vis谱图都很相似，因此我们发现保留时间仍是较为可靠的峰鉴定参数（对于有标准品的SG）。
线性
所有15种SG的峰面积和浓度之间都呈线性关系。标准曲线采用最小二乘回归模型拟合而得。所有化合物的决定系数（R2）都至少为0.999。将标准曲线上最低浓度水平的响应（峰面积）的标准差（n=5）乘以10，再除以标准曲线的斜率，估算出这些化合物的定量限（LOQ）。估算出的LOQ在0.001~0.004 mg/mL范围内。
表5. 峰面积与浓度之间的线性关系以及估算出的定量限。
加标回收率
选择三个不同形式和种类的三个样品中加标两个浓度的SG(Reb N和Reb M)来评估分析准确度。下图显示了加标结果。在大多数情况下，平均回收率（n=2）都在100±10%范围内，只有以低浓度水平加标Reb M的样品B得到了一个例外结果（111.8%）。
表6. 三种样品基质中甜菊糖苷的加标回收率结果。
精密度
在分析样品时使用QC标准品评估保留时间精密度。15种SG的保留时间相对标准差在0.15%~0.33%范围内（结果未显示）。
样品分析
样品A的SG特征很简单，主要组分是Reb A。其他样品（例如样品B、C、D、F）的SG色谱特征较为复杂。这些样品中存在许多该HPLC-UV方法可能无法鉴定的峰（可能是次要SG）。根据JECFA专论26的建议，在分析SG特征如此复杂的甜叶菊提取物时可能需要使用质谱仪来帮助鉴定化合物。
表7. 甜叶菊提取物样品分析结果汇总。
图4. 在实验开发的条件下使用Xselect Premier HSS T3 VanGuard FIT色谱柱（2.5 μm，4.6 mm x 150 mm）分析含15种甜菊糖苷的混标以及甜叶菊提取物产品（样品A、B、C、D、F）得到的HPLC-UV色谱图。
结论
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配备2998 PDA检测器和XSelect Premier HSS T3色谱柱的Arc Premier系统优化了分析甜菊糖苷的JECFA梯度LC-UV方法，使得SG的色谱分离度显著提高，也为后续连接质谱表征提供便利。
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在XSelect Premier HSS T3色谱柱（2.5 μm， 4.6 mm x 150 mm）上，关键分析物对（Reb A/SV）轻松达到了1.5及更高的分离度。
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实验证明，线性、灵敏度、准确度、精密度和稳定性这几方面的分析性能也表现优异。本研究开发的方法有望成为甜菊糖苷分析的一种有用替代方法。
同时已开发在ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（1.8 μm, 3 mmx150 mm）上的分离，分离度更是达到了2.0，进一步和质谱检测适配。感兴趣的老师们欢迎扫描下方二维码，获取更多Premier和方案信息。
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仪器推荐
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参考资料
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