EAD Talk：ZenoTOF 8600质谱全新EaciD碎裂方式，突破糖肽分析瓶颈

基于电子捕获的可调谐碎裂技术，突破CID技术的局限，保留糖肽侧链修饰信息，实现不稳定聚糖修饰的位点特异性定位，同时产生独特碎片离子，提升肽主链信息的完整性。

将EAD与CID结合，先通过 EAD保留修饰与主链信息，再通过CID产生更多聚糖碎片离子，兼顾糖肽鉴定的全面性与聚糖结构解析的准确性。

灵敏度提升10倍以上，可实现低丰度糖肽的高效鉴定，且大幅降低样品用量。

整合蛋白与聚糖双数据库，采用肽基检索、糖基检索、从头测序三步法分析谱图，同时可计算糖型相对丰度，实现糖肽鉴定与聚糖结构解析的一体化。

图1. α2 - 糖蛋白 HS 糖肽的 EAD 谱图

质谱分析分别在 ZenoTOF 8600系统和ZenoTOF 7600+系统进行。DDA采集策略，TOF MS扫描范围 400–2000m/z，积累时间0.1s；TOF MS/MS扫描范围100–2000m/z，积累时间0.2s。EAD参数设置如下：电子能量7eV，反应时间10ms，电子束电流5500nA。

质谱原始数据使用PEAKS GlycanFinder2.0软件进行糖肽鉴定。数据库为UniProt人血浆蛋白库及软件内置的1867种 N-糖链结构库（图2）。

图2. PEAKS GlycanFinder软件的

糖肽数据库检索与从头测序流程

本研究采用商品化HILIC离心柱对depleted人血浆酶解产物进行糖肽富集，并与富集前样本进行对比。结果显示（图3）：富集前样本中糖肽占比仅为12%，而富集后糖肽占比飙升至 88%。三次技术重复实验中共鉴定到超过1500条独特N-糖肽，相当于从1μL原始血浆中获得的糖肽信息量。这一结果表明，商品化 HILIC富集柱的富集效率与实验室自制富集柱相当，适用于低丰度糖蛋白质组学研究。

图3. N-糖肽富集后鉴定结果

鉴于灵敏度的提升，研究进一步针对ZenoTOF 8600系统优化了核心DDA采集参数-最大候选离子数与二级质谱累积时间（EAD/EAciD）。实验发现，最佳参数组合与样本载量存在强相关性：在1μg低上样量时，最优参数（9个候选离子，200ms累积时间）与前代保持一致，表明基础采集逻辑的延续性；而当上样量提升至2~5倍区间时，最优候选离子数需上调至12~15个。这一调整有效利用了充裕的样本量，通过增加单位时间内的碎裂事件数，捕获了更多共洗脱或低丰度的糖肽特征。

图4. DDA方法与上样量的优化

在优化采集参数的基础上，研究转向色谱分离维度，探讨了梯度时长对糖肽鉴定的增益效应。延长反相色谱梯度（从50min延长至100-150min）本质上是增加了正交分离空间，有效缓解了复杂糖肽混合物在短梯度下的共洗脱现象，从而使得更多的糖肽得以脱离基质干扰，被质谱有效识别。数据显示，延长梯度显著增加了糖肽的鉴定总数，这验证了在复杂翻译后修饰分析中，“分离能力”与“检测能力”同等重要。值得注意的是，在100min梯度下将最大候选离子数从9提升至15并未带来鉴定数的提升。

图5. LC梯度对糖肽鉴定数量的影响

为评估不同碎裂方式对糖肽鉴定的影响，研究对比了 EAD单独碎裂与EAciD（EAD + CID）双重碎裂模式的鉴定性能。EAD碎裂可保留完整糖链信息，产生丰富的 c/z 离子，用于糖基化位点精准定位；EAciD则在EAD基础上叠加CID碎裂，进一步增强肽骨架碎片信号。

图6. EAciD碎裂技术示意图

图7. α2-糖蛋白HS糖肽的EAciD谱图

本研究以Fibronectin蛋白N542位点为例，展示了糖型分布解析的实际应用价值。Fibronectin是一种重要的细胞外基质蛋白，其糖基化已被证实参与细胞黏附和迁移过程，糖型分布的变化可能与肿瘤发生、转移等病理过程相关。不同糖型可能通过影响Fibronectin 的构象、稳定性和受体识别能力，进而调控其生物学功能。例如，某些糖型可能增强细胞黏附，而另一些糖型可能促进细胞迁移。这种糖型分布的动态变化为疾病状态监测和治疗靶点发现提供了新的视角。

图8. 人血浆中纤连蛋白N542位点鉴定出的不同聚糖相对丰度