现有技术瓶颈
· DNA 甲基化（5mC、5hmC）是调控基因表达和细胞谱系分化的关键表观遗传标记，但传统单细胞甲基化分析缺失组织空间构象，无法解析细胞间微环境调控机制。
· 现有空间多组学技术仅能检测转录组、染色质可及性或蛋白质，缺乏直接检测 DNA 甲基化的方法，导致表观遗传调控与基因表达的空间互作研究受限。
? 研究方法
· 开发一种可在同一组织切片上同步捕获 DNA 甲基化和转录组的空间组学技术，实现近单细胞分辨率的双模态分析。
· 揭示小鼠胚胎发育和脑功能中，DNA 甲基化（mCG、mCH）与基因表达的空间协同调控规律，为组织生物学研究提供新工具。
Spatial-DMT 整合微流控原位条形码、酶促甲基化转化和高通量测序技术。
图1 Spatial-DMT实验流程
图2 Spatial-DMT文库结构
1
? 样本制备
选取目标组织（如小鼠胚胎、脑），制备 7-10 μm 厚的冷冻切片，贴附于多聚赖氨酸包被的载玻片上，避免组织脱落。
若为新鲜样本，需经 CO?麻醉后快速灌注冷 DPBS，脑组织需嵌入 OCT 化合物中干冰速冻，确保核酸完整性。
? 试剂与设备准备
核心试剂：1% 甲醛（固定用）、0.1N HCl（核小体破坏）、Tn5 转座酶及缓冲液、生物素标记的 poly-dT 引物（含 UMI 和通用接头）、空间条形码 A/B（各 50 种序列）、TET2/APOBEC 酶（EM-seq 转化用）、链霉亲和素磁珠、splint 连接适配器、高保真 DNA 聚合酶。
专用设备：微流控芯片（通道宽度 20/50 μm）、PCR 仪、荧光显微镜（10× 物镜，用于芯片对齐）、高通量测序仪（Illumina NovaSeq 6000/X Plus）。
2
组织预处理
（关键：保护核酸完整性）
? 固定与透化
将冷冻切片在 37℃孵育 1 分钟快速解冻，用含 0.05 U/μL RNase 抑制剂的 1% 甲醛室温固定 10 分钟，随后用 1.25 M 甘氨酸淬灭 5 分钟，去除过量甲醛。
? 清洗与 permeabilization
用 DPBS-RI（含 RNase 抑制剂）洗涤组织 2 次，再用 0.5% Triton X-100+RNase 抑制剂室温透化 30 分钟，增强试剂穿透力。
? 核小体破坏
加入 0.1N HCl 室温处理 5 分钟，破坏组蛋白与 DNA 的结合，提升 Tn5 转座酶可及性，随后用含 BSA 和 Tween 20 的洗涤缓冲液洗涤 2 次，中和酸性环境。
3
双模态分子捕获
（核心：同步捕获 DNA 与 mRNA）
配制转座混合液（含组装好的 Tn5 转座酶、Tagmentation 缓冲液、洋地黄皂苷、Tween 20、RNase 抑制剂），均匀覆盖组织，37℃孵育 60 分钟。
更换新鲜转座混合液，进行第二轮转座（60 分钟，37℃），平衡 DNA 产量与 RNA 降解风险，将基因组 DNA 片段化至合适长度。
加入 40 mM EDTA 室温孵育 5 分钟终止转座，用 缓冲液洗涤 1 次。
配制 RT 反应液（含 5×RT 缓冲液、PEG-8000、dNTPs、Maxima H Minus 逆转录酶、生物素标记的 poly-dT 引物、RNase 抑制剂），覆盖组织后室温孵育 30 分钟，再 45℃恒温 90 分钟完成 cDNA 合成。
反应后用缓冲液洗涤，去除未结合的游离引物。
4
空间条形码标记
（核心：赋予分子空间坐标）
将微流控芯片对齐组织感兴趣区域（ROI），用自制丙烯酸夹具固定，通过荧光显微镜拍摄明场图像确认定位。
条形码 A 与连接接头预先退火，配制含 T4 DNA 连接酶、缓冲液、Triton X-100 的连接混合液，通过真空驱动流入芯片通道，37℃孵育 30 分钟，使条形码 A 共价连接到 DNA 和 cDNA 的通用接头。
去除芯片，用缓冲液洗涤，干燥载玻片。
更换垂直方向的微流控芯片，重复上述定位与固定步骤，将退火后的条形码 B 连接混合液流入通道，37℃孵育 30 分钟，形成 “条形码 A + 条形码 B” 的二维空间编码（共 2500 个像素）。
去除芯片，用去离子水洗涤，压缩空气吹干，再次拍摄明场图像用于后续空间定位校准。
5
? 逆转交联与组织裂解：
在 ROI 区域加入含 0.4 mg/mL 蛋白酶 K、1% SDS、EDTA 的逆转交联混合液，58-60℃孵育 2 小时，随后 60℃振荡孵育过夜，彻底释放核酸。
? 核酸提取：
收集裂解液，用 柱式DNA纯化试剂盒纯化，洗脱得到含 gDNA 和 cDNA 的混合液。
? 双模态分离：
将混合液与预洗涤的链霉亲和素磁珠室温孵育 1 小时，利用生物素 - 链霉亲和素相互作用富集 cDNA（磁珠结合相），gDNA 则留在上清液中，实现两者分离。
6
文库构建
（gDNA 甲基化文库与 cDNA 转录组文库）
酶促转化：取 gDNA 上清液，加入 TET2 反应混合液（含 TET2 酶、氧化增强剂、Fe2?溶液）37℃孵育 1 小时，将 5mC/5hmC 氧化为 5caC；随后加入 APOBEC 酶 37℃孵育 3 小时，将未修饰的 C 脱氨基为 U，修饰 C 则被保护。
splint 接头：将转化后 gDNA 热变性（95℃3 分钟），快速冰浴 2 分钟，加入预退火的 SLP5 适配器和连接混合液（含 T4 PNK、T4 连接酶、PEG 8000），37℃孵育 45 分钟，引入 PCR 接头，65℃20 分钟灭活酶活性。
PCR 扩增：用 耐尿嘧啶聚合酶进行 13-19 轮扩增，引物含 N501 和修饰后的 N70X-HT（C→T 替换，避免脱氨基干扰），扩增后用 0.8×磁珠纯化，得到甲基化文库。
模板切换反应：将结合 cDNA 的磁珠洗涤后，重悬于含模板切换寡核苷酸（TSO）、Maxima 逆转录酶的反应液中，室温孵育 30 分钟、42℃孵育 90 分钟，延长 cDNA 链并引入接头序列。
Tagmentation 与扩增：用 酶切 试剂盒对 cDNA 进行片段化，加入index引物进行 12 轮 PCR 扩增，通过 0.7×磁珠纯化，获得含空间条形码的转录组文库。
7
用 Agilent Bioanalyzer D5000 检测文库片段大小（目标范围 200-500 bp），Qubit 定量浓度，确保文库浓度≥1 ng/μL。
验证甲基化文库转化效率：检测甲基化 - free linker 序列，确保 > 99% 的 C 成功转化为 U；转录组文库需验证无 Poly A/T 或 TSO 序列污染。
8
? 文库采用 Illumina NovaSeq 6000/X Plus 进行 150 bp 双端测序，测序深度需满足：每个像素平均 35 万 - 75 万条 reads，确保 CpG 覆盖度≥13 万 / 像素、基因检出数≥1800 / 像素。
? 数据预处理：通过条形码 A/B 组合解码空间坐标，用 STARsolo 映射 RNA 读段、BISCUIT 处理 DNA 甲基化读段，最终通过 MethSCAn（识别 VMRs）和 Seurat（聚类分析）生成双模态空间图谱。
? 突破现有空间组学技术的局限，首次实现 DNA 甲基化与转录组的空间双模态共分析，拓展了空间组学的研究维度。
? 采用 EM-seq 酶促转化替代亚硫酸氢盐处理，减少 DNA 损伤，同时保留 mCG 和 mCH 修饰信息，且无需区分 5mC 和 5hmC（二者共同被保护免受脱氨基）。
揭示了甲基化调控的空间特异性：同一甲基化修饰在不同组织、细胞类型中对基因表达的调控方向（正 / 负相关）存在差异，强调了空间语境的重要性。
为胚胎发育研究提供新视角：通过时空整合分析，清晰展示了甲基化介导的细胞分化轨迹（如少突胶质细胞从亚大脑皮层向大脑皮层迁移）。
阐明了非 CpG 甲基化（mCA）在脑功能中的调控作用，为神经元发育和脑疾病研究提供新靶点。
Spatial-DMT 关键试剂清单
类别 | Spatial-DMT使用的试剂 | 翌圣生物 | 作用 | |
对应产品名称 | 对应产品货号 | |||
分子酶或试剂盒 | T4 DNA Ligase/T4 DNA Ligase Reaction Buffer | Hieff NGS? Rapid DNA Ligase Module | 12999ES | 用于 barcode 连接 |
NEBNextò Enzymatic Methyl-seq Conversion Module | DNA Enzymatic methyl-Conversion Kit | 12213ES | 酶法转化 | |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Hieff NGS? C112P1 Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina? (for 1 ng) | 13468ES | 转座酶切建库 | |
VeraSeq Ultra DNA polymerase | Hieff Canace? Plus High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶 | 12928ES | 耐U高保真DNA扩增 | |
Proteinase K | Proteinase K Solution 蛋白酶K溶液（20 mg/mL, RNase-Free, DNase-Free） | 10412ES | 降解组织蛋白，释放核酸 | |
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | 2× Ultima HF Amplification Mix /高保真DNA文库扩增模块 | 13344ES | 高保真 DNA 扩增反应 | |
Kapa Hotstart HiFi ReadyMix | 2× Hieff Canace? Pro Amplification Mix | 12980ES | 启动动高保真文库扩增 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | YeaGreen Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water) | 10204ES | 核酸染料 | |
DNA Clean & Concentrator-5 | MolPure? PCR Purification Kit PCR产物纯化试剂盒 | 19106ES | DNA纯化 | |
Tn5 Transposase - unloaded/Tagmentation Buffer (2x) | Tn5 Transposase (10 U/μL) | 14524ES | 用于基因组 DNA 片段化，插入测序接头 | |
Maxima H Minus Reverse Transcriptase (200 U/μL) | Hifair UCF. ME? Advanced Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 14614ES | 以 mRNA 为模板合成 cDNA | |
dNTP mix | dNTP Mix (10 mM each) | 10124ES | DNA 合成等反应的原料 | |
RNase Inhibitor (40 U/ml) | RNase Inhibitor | 14672ES | 抑制 RNA 酶活性，防止 mRNA 降解 | |
SPRI beads | Hieff NGS? DNA selection Beads | 12601ES | 纯化 DNA/RNA 文库，去除杂质 | |
Dynabeads MyOne C1 | Hieff NGS? Cap Beads 链霉亲和素捕获磁珠 | 12248ES | 捕获生物素标记的核酸 | |
生化试剂 | Formaldehyde solution（甲醛溶液） | 4%多聚甲醛固定液 | 60536ES | 用于组织样本固定，保持细胞形态和分子完整性 |
Glycine（甘氨酸） | Glycine 甘氨酸 | 60112ES | 淬灭过量甲醛，终止固定反应 | |
NaCl（氯化钠） | Sodium Chloride 氯化钠 | 60372ES | 维持缓冲液渗透压和离子强度 | |
MgCl?（氯化镁） | 无水氯化镁 | 719460ES | 为 Tn5 转座酶、DNA 连接酶等提供反应条件 | |
Digitonin（洋地黄皂苷） | Digitonin洋地黄皂苷 | 54004ES | 温和通透细胞膜，保留核内分子完整性 | |
Sodium dodecyl sulfate（SDS，十二烷基硫酸钠） | SDS | 20106ES | 裂解细胞膜和核膜，释放核酸 | |
HEPES pH 7.5（HEPES 缓冲液） | HEPES hemisodium salt HEPES半钠盐 | 715389ES | 维持实验体系 pH 稳定 | |
EDTA Solution pH 8.0（EDTA 溶液） | EDTA, Free Acid 乙二胺四乙酸 | 60126ES | 螯合镁离子，终止依赖金属离子的酶促反应（如转座、连接） | |
Bovine Serum Albumin (BSA)（牛血清白蛋白） | 牛血清白蛋白，诊断级别 | 36102ES | 稳定酶活性，减少非特异性结合 | |
Triton X-100（曲拉通 X-100） | Triton X-100 | 20107ES | 增强细胞膜通透性，辅助试剂渗透 | |
参考文献
[1] Lee C N, Fu H, Cardilla A, et al. Spatial joint profiling of DNA methylome and transcriptome in mammalian tissues[J]. bioRxiv, 2025: 2025.07.01.662607. https://doi.org/10.1101/2025.07.01.662607
翌圣生物
翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事核苷酸、蛋白、细胞和类器官四大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。公司兼备核心技术自主研发和规模化生产能力，核心产品数量达数千种，覆盖分子克隆、qPCR、NGS、体外转录、抗体、蛋白纯化及分析、细胞培养、转染、报告基因检测和类器官等多种系列，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。
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