? cfDNA 是血浆中游离的 DNA 片段，反映细胞更新状态，其甲基化测序可解析组织来源（TOO）、染色质结构等关键信息，是液体活检的重要技术手段。
? cfDNA 存在非随机片段化特征：核小体保护区域免受核酸酶降解，且该区域甲基化水平显著高于开放染色质，因此 cfDNA 整体甲基化水平高于基因组 DNA。
? dsDNA 建库需通过酶促末端修复将 cfDNA 的不规则末端补平为平末端，此过程会引入新合成的未甲基化核苷酸，可能降低片段末端的 CpG 甲基化水平；而 ssDNA 建库省略该步骤，可直接连接接头并保留天然末端特征。
从全血中提取血浆 cfDNA，使用 Qubit 荧光计和 Agilent TapeStation 进行定量和片段大小检测。(推荐翌圣生物cat#18382ES)以1 ng cfDNA 为起始量，分别构建两种文库：dsDNA 文库构建(推荐翌圣生物cat#12214ES)，ssDNA 文库构建(推荐翌圣生物cat#12221ES)，均扩增11 个循环。
文库在 Illumina NextSeq? 2000 测序，采用 2×66 bp 读长；通过 SeqPrep2、bwa-meth、Picard 等工具完成接头修剪、序列比对、重复序列标记。
用 MethylDackel 提取 CpG 位点甲基化信息，设置最小测序深度、最小比对质量、20为筛选阈值。
基于 NucPosDB 的核小体图谱，将其调整为 1 bp 中点分辨率，用 bedtools 计算 CpG 位点到核小体中心的距离，分析甲基化与核小体位置的关联。
采用 Loyfer 等的人正常细胞甲基化图谱（GSE186458），选取 13 种 cfDNA 相关组织（如血管内皮、粒细胞、肝细胞等）作为参考。
用非负最小二乘法（NNLS） 进行 TOO 推断，按70% 训练 / 30% 测试进行 100 次随机迭代，以决定系数（R2） 和均方误差（MSE） 评估推断效果。
对 dsDNA 测序读段分别修剪20 bp和40 bp，重新分析甲基化水平和 TOO 推断效果，对比不同修剪长度的校正作用。
本研究通过两个 cfDNA 提取物的配对文库验证，得到以下关键结果，核心文库基础数据见下表：
表 1 两种建库方法的文库基础特征
图1 GC位点甲基化水平
结果显示：
? dsDNA 文库存在显著的甲基化分布偏差
dsDNA 文库的 CpG 甲基化水平从读段~40 bp开始逐步下降，反向模板读段 3' 端出现急剧的甲基化丢失；而 ssDNA 文库在整个读段中保持均匀的甲基化水平。
核小体层面：dsDNA 文库在核小体二联体下游出现链特异性的低甲基化，与末端修复补平 5' 突出端引入未甲基化胞嘧啶的机制一致；ssDNA 文库则在核小体二联体两侧呈对称的甲基化分布。
? dsDNA 文库全局甲基化水平显著降低
末端修复导致 dsDNA 文库在核小体相控区域的全局 CpG 甲基化水平降低约 5–7%，该偏差叠加在核小体核心区固有的甲基化低谷之上。
? dsDNA 文库降低 TOO 推断的准确性
dsDNA 文库因引入未甲基化胞嘧啶，高甲基化 CpG 位点的占比被低估，部分甲基化位点的丰度异常升高；而 ssDNA 文库能保留核小体保护区域的高甲基化特征，更贴合 cfDNA 原生状态。
TOO 推断中，ssDNA 文库在高信息度 CpG 子集（甲基化率 <0.2 或> 0.8、<0.1 或 > 0.9）中始终表现出更高的 R2和更低的 MSE；而无生物学信息的未甲基化对照 CpG 位点，两种文库的推断效果无显著差异。
? 读段末端修剪可部分校正甲基化偏差，但存在权衡
对 dsDNA 读段进行 20/40 bp 末端修剪后，甲基化水平向 ssDNA 文库趋近，TOO 推断的 R2 提升、MSE 降低，40 bp 修剪可基本恢复 dsDNA 甲基化的保真度（需将 ssDNA 数据降采样至相同深度）。
修剪的弊端：显著降低独特测序覆盖度，并丢失片段末端坐标，导致片段组学分析的关键信息缺失。
dsDNA 甲基化双链建库中的酶促末端修复步骤是导致 cfDNA 甲基化水平低估的关键因素。
产品名称 | 产品货号 | 产品应用 |
Hieff Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit | 12228ES | 柱式法甲基化转化 |
Hieff Mag Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit | 12229ES | 磁珠法甲基化转化 |
Hieff NGS Methyl-seq ssDNA library Prep kit for Illumina V2 | 12221ES | 单链甲基化文库构建Illumina |
Hieff NGS Methyl-seq ssDNA library Prep kit for MGI V2 | 12226ES | 单链甲基化文库构建MGI |
Hieff NGS dsDNA Methyl Library Prep Kit for Illumina | 12214ES | 双链甲基化文库构建 |
Hieff UltraShear | 12218ES | 甲基化片段化酶 |
Hieff Canace Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase mix | 12928ES | 甲基化转化后PCR扩增 |
参考文献
[1] GROTH T E, MISHIN A A, RAO V, et al. End-repair causes methylation underestimation in cell-free DNA sequencing libraries[EB/OL]. bioRxiv Preprint, 2025[2025-12-17]. https://doi.org/10.64898/2025.12.15.694439.
翌圣生物
翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事核苷酸、蛋白、细胞和类器官四大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。公司兼备核心技术自主研发和规模化生产能力，核心产品数量达数千种，覆盖分子克隆、qPCR、NGS、体外转录、抗体、蛋白纯化及分析、细胞培养、转染、报告基因检测和类器官等多种系列，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。
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