初步探究电转法用于modRNA细胞转染

摘要

本文旨在探讨电转法（电穿孔法）在修饰的信使核糖核酸（modRNA）细胞转染中的应用效果及相关特性。通过优化电转参数，实现了在HEK293和HeLa细胞系中高效的modRNA转染，并评估了转染效率、细胞活力及基因表达水平。本研究为modRNA在基因功能研究、细胞治疗等领域的进一步应用提供了实验基础。

引言

在现代分子生物学与细胞生物学研究领域，将外源核酸分子高效地导入细胞内是一项极为关键的技术手段。其中，modRNA修饰技术的出现为基因表达调控、疾病治疗等多方面研究开辟了新的途径。而实现modRNA在细胞内的有效转染则成为发挥其功能的首要步骤。传统的细胞转染方法包括脂质体转染、磷酸钙沉淀法等，但这些方法存在转染效率低、细胞毒性大等缺点。电转法作为一种广泛应用的细胞转染技术，具有独特的优势，本文旨在初步探索其在modRNA细胞转染中的应用效果及相关特性。

构建电转法转化体系的意义

电转法基于电场作用使细胞膜通透性瞬间改变，从而促使外源物质进入细胞。相较于传统方法，电转法具有适用细胞范围广、转染效率较高等优点，在DNA转染等方面已有诸多成功应用案例。然而，将电转法应用于modRNA转染仍需要深入探究其转染参数、对细胞生理状态的影响等多方面因素，以便为modRNA在基因功能研究、细胞治疗等领域的进一步应用奠定基础。

材料与方法1. 细胞培养

本研究选用了常见的细胞系，如HEK293细胞与HeLa细胞。HEK293细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中，在37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。HeLa细胞则采用含15%FBS、1%谷氨酰胺的RPMI-1640培养基，同样在37°C、5% CO₂条件下培养。细胞培养至对数生长期后用于后续实验。

2. modRNA合成

采用体外转录合成的方法制备modRNA。首先，根据目标基因序列设计并合成相应的DNA模板，在转录反应体系中加入T7 RNA聚合酶、NTP混合物以及修饰核苷酸等成分，在适宜的温度与缓冲条件下进行转录反应。反应结束后，利用无RNase的DNase I去除DNA模板，然后通过RNA纯化试剂盒对转录产物进行纯化，获得高纯度的modRNA。经紫外分光光度计测定其浓度与纯度，确保用于转染实验的modRNA质量符合要求。

3. 电转参数设置与操作

选用威尼德电转仪，设置多组电转参数进行实验。包括不同的电压强度（如100V-300V）、脉冲时间（如5ms-20ms）以及脉冲次数（1-3次）等组合。将处于对数生长期的细胞收集，用预冷的电转缓冲液重悬，调整细胞密度至合适浓度。将适量的modRNA与细胞悬液混合后加入电转杯，按照设定的电转参数进行电击操作。电击后，立即将细胞转移至预热的完全培养基中继续培养，在不同时间点（如24小时、48小时、72小时）收集细胞进行后续检测。

实验结果1. 转染效率检测

采用荧光素酶报告基因系统检测modRNA的转染效率。在modRNA转录过程中，将荧光素酶基因序列整合其中。通过检测细胞内荧光素酶的活性来反映modRNA的转染效率。在转染后的不同时间点，收集细胞，裂解后加入荧光素酶底物，利用酶标仪测定发光强度，与标准曲线对比计算出相对荧光素酶活性，从而确定转染效率。

在HEK293细胞的电转实验中发现，电压强度、脉冲时间和脉冲次数等电转参数对modRNA转染效率有着显著影响。当电压为200V、脉冲时间为10ms、脉冲次数为2次时，在转染后48小时检测到相对较高的荧光素酶活性，表明此时的转染效率较高。而在较低电压（如100V）或过高电压（如300V）时，转染效率均明显下降。类似地，脉冲时间过长或过短以及脉冲次数不适宜都会导致转染效率降低。在HeLa细胞中也呈现出相似的规律，但最佳电转参数略有不同，为电压250V、脉冲时间15ms、脉冲次数2次。

2. 细胞活力检测

运用CCK-8法测定细胞活力。在电转后不同时间，向细胞培养孔中加入CCK-8试剂，在细胞培养箱中孵育一定时间后，利用酶标仪测定450nm处的吸光度值。根据吸光度值的变化评估电转过程对细胞活力的影响，以未电转的细胞作为对照，计算细胞活力百分比。

CCK-8法检测结果显示，电转过程在一定程度上会影响细胞活力。与未电转的对照组相比，在电转后24小时，细胞活力有较为明显的下降，尤其是在较高电压或较长脉冲时间的电转条件下。但随着时间推移，细胞活力逐渐恢复，到72小时时，部分电转组细胞活力已接近对照组水平。这表明细胞对电转操作具有一定的自我修复能力，但过度的电场刺激仍会对细胞造成较为严重的损伤。

3. 基因表达水平检测

利用实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测转染细胞内目标基因的表达水平。提取电转后细胞的总RNA，反转录为cDNA，然后以特异性引物进行qRT-PCR扩增反应。通过与内参基因（如GAPDH）的表达量对比，计算目标基因的相对表达量，分析modRNA转染后在细胞内的基因表达调控效果。

qRT-PCR检测结果表明，成功转染modRNA后，细胞内目标基因的表达水平显著升高。在最佳电转参数条件下，转染后24小时即可检测到目标基因表达量的明显增加，并且在48小时-72小时内维持在较高水平。这说明通过电转法导入的modRNA能够在细胞内有效地进行翻译表达，发挥其基因调控功能。

讨论1. 电转法用于modRNA细胞转染的可行性

本研究初步探索了电转法在modRNA细胞转染中的应用，结果显示电转法在合适的参数条件下能够实现较高的modRNA转染效率，并且能够有效调控细胞内基因表达。这表明电转法是一种可行的modRNA转染方法，为modRNA在基因功能研究、细胞治疗等领域的进一步应用提供了实验基础。

2. 电转参数的优化

电转参数对modRNA转染效率具有显著影响。本研究通过筛选不同电压强度、脉冲时间和脉冲次数等组合，找到了在HEK293和HeLa细胞系中转染modRNA的最佳电转参数。然而，不同细胞系的最佳电转参数存在差异，这提示我们在实际应用中需要根据细胞类型进行电转参数的优化。未来研究可以开发智能化的电转设备，能够根据细胞类型自动调整电转参数，提高转染效率并减少对细胞的损害。

3. 电转法对细胞生理状态的影响

电转过程在一定程度上会影响细胞活力，但细胞具有自我修复能力。本研究发现，在较高电压或较长脉冲时间的电转条件下，细胞活力明显下降，但随着时间推移，细胞活力逐渐恢复。这表明在合适的电转参数下，电转法对细胞的损伤是可控的。未来研究可以进一步探究减轻细胞损伤的方法，如优化电转缓冲液成分等。

4. 研究的创新与应用前景

本研究创新地将电转法应用于modRNA细胞转染，并通过优化电转参数实现了高效的转染效率。这为modRNA在基因治疗、细胞工程等领域的广泛应用提供了新的技术手段。未来研究可以结合其他新兴技术，如纳米技术，探索新的modRNA转染策略，以克服电转法当前存在的不足，推动modRNA技术的进一步发展。

结论

本研究初步探索了电转法在modRNA细胞转染中的应用，结果显示电转法在合适的参数条件下能够实现较高的modRNA转染效率，并且能够有效调控细胞内基因表达。然而，电转法也存在一些局限性，如细胞活力的影响和电转参数的优化等。未来研究可以从减轻细胞损伤、优化电转参数和开发智能化电转设备等方面展开，以推动modRNA技术在基因治疗、细胞工程等领域的广泛应用。

本研究为modRNA的细胞转染提供了新的技术手段，为modRNA在基因功能研究、疾病治疗等方面的进一步应用奠定了实验基础。随着技术的不断进步和创新，电转法在modRNA细胞转染中的应用前景将更加广阔。