【柏恒科技小课堂】超微量分光光度计你了解多少！

1.能够测量微量样品的吸光度，通常在纳升至微升级别。

2.高灵敏度和精确度，能够准确测量核酸和蛋白质的浓度。

3.通常采用紫外-可见分光光度法进行测量。

4.一般具有紧凑的设计和易操作的特点。

核酸和蛋白质在紫外-可见光波长范围内具有特定的吸光特性。

通过将样品放置在光路中，利用光源照射样品，测量样品在特定波长下透射或反射的光强，即吸光度。根据样品在特定波长下的吸光度值，结合已知的标准曲线或专门的软件，可以计算出核酸或蛋白质的浓度。

超微量分光度计是一种常用的测定DNA和RNA浓度的方法。

通过测量特定波长下的光密度（OD值），可以间接计算出核酸的浓度。

以下是该方法的基本原理和操作步骤：

OD是optical density的缩写，表示被检测物质吸收的光密度。由于核酸中的碱基具有共双键结构，因此它们具有紫外光吸收特性。

OD260：DNA双链的吸收峰，主要反映DNA的浓度。
OD280：芳香族氨基酸的吸收峰，主要用于判断蛋白质污染程度。
OD230：核酸提取过程中使用的盐离子在230nm处有吸收峰，如果OD230很高，说明盐离子浓度较高。

OD260/OD280的比值用于判断RNA或DNA的纯度。高纯度的DNA比值应该在1.8-2.0之间。

如果比值低于1.8，说明蛋白质污染较严重；高于2.0，则说明可能有RNA污染。

准备核酸样品：将待测的DNA或RNA样品溶解在适当浓度的缓冲液中。

测量OD值：使用产微量分光光度计，分别测量260nm、280nm和230nm处的光密度。

计算浓度：根据已知的摩尔消光系数，计算DNA或RNA的浓度。

注意事项 
实验过程中要避免蛋白质和盐离子的污染，否则会影响结果的准确性。
测量时要保持样品池和空白池的清洁，避免杂质干扰。

常见的用途

无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域 ,还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门 ,紫外可见分光光度计督有广泛而重要的应用。分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

超微量分光光度计已成为现代分子生物实验室常规仪器。

常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

核酸的定量是超微量分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。

核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。

如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。

测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。

读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。

纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。

蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5 之间。

实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。

蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。

OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。

另外，需注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。