Biomek i5自动化移液工作站+Evotip Pure，解锁高通量蛋白质组学可扩展分析能力

随着采集速度更快、灵敏度更高的质谱仪产品的相继问世，蛋白质组学已跃升为引领学术探索和工业研究多个应用领域的重要工具。

随着蛋白质组学研究的不断深入以及样品分析日益常态化，对标准化和可扩展解决方案的需求愈发迫切。为了满足这一需求，我们专门为Biomek i5自动化移液工作站量身打造了四项全新升级的全自动工作流程。这些流程与 Evosep 技术无缝集成，可确保高效、可重复的端到端样品制备。Biomek i5自动化移液工作站可并行处理多达6块孔板，单次运行可轻松处理576份样品，并且样品可自动加载至Evotips进行分析。该过程显著缩短了上样时间，6块板的消化酶解过程仅需3小时，过夜消化仅需18小时。

该工作流程采用原装密封专用适配器，可在 Evotip 上实现样品自动脱盐和上样，以便在下游 LC-MS 分析前高效储存样品。

PAC（蛋白聚集捕获）¹消化酶解工作流程，利用蛋白在磁珠表面的聚集，直接在磁珠上消化还原和烷基化蛋白质裂解物。

该工作流程将还原与烷基化步骤相结合，利用 PAC 消化酶解作为大队列血浆样品的简化处理方法。

Mag-Net（富集）²工作流程将膜结合囊泡的富集与 PAC消化酶解过程全面结合，有利于血浆蛋白质组学的深度研究。

首先，将 HeLa细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中培养，随后加入5%的SDS缓冲溶液煮沸收获。实验过程中，采用了搭载300μl的多通道移液头的Biomek i5 MC（）自动化移液工作站、BioShake（D30-T elm, Q-Instruments）和Magnum FLX 磁力载架（Alpaqua）。

进行 PAC 消化酶解时，将1μg HeLa裂解物与5μl MagReSyn羟基磁珠（Resyn Biosciences）混合。将异丙醇添加至80%的浓度并在BioShake模块上混匀。蛋白结合在磁珠上后，用异丙醇进行一次洗涤，之后，在 37°C 或环境温度（板间变异实验）下用 40ng 胰蛋白酶（T6567, Sigma Aldrich）和 10ng Lys-C（129-02541, Wako Fujifilm）进行过夜（16小时）消化酶解。将样品稀释至适当浓度，然后再上样至Evotips。

血浆按照早期检测研究网络（EDRN）规定的标准操作流程³进行提取。进行纯血浆分析时，在稀释之前将 1 μl 血浆进行裂解、还原和烷基化，并使用约2 μg蛋白进行消化酶解。之后加入5 μl羟基磁珠开始PAC消化酶解步骤。消化酶解后，将所得肽段的40%上样至 Evotips。进行Mag-Net富集时，将4 μl血浆与磁珠结合缓冲液和1 μl MagReSyn SAX磁珠（ReSyn Biosciences）按1:1比例混合。随后在三次洗涤以及一锅法裂解、还原和烷基化步骤后，如上所述步骤进行 PAC 消化酶解。在37°C下过夜消化酶解后，将所得肽段的80%上样至Evotips。

该工作流程旨在实现高效且具成本效益的大队列样本分析。将 Evotip 上样作为每个工作流程的最后步骤，样品将安全储存至 Evotip Pure，直至完成 LC-MS 分析。这种方法通过仅消化所分析的内容，利用和分析接近100%的消化样品，通过减少酶和样品消耗来最大限度地降低每个样品的成本。此外，该工作流程使用单一样品专用吸头和共用移液吸头，可确保高通量样品制备的持续运行。采用孵育步骤以交叉方式处理多个96孔板，显著提高了整体实验通量。因此，当同时处理6块每块内含96份样品的孔板时，每个工作流程中每份样品的总处理时长不到 2 分钟，总共仅需 18小时的处理时间。

采用 500 SPD 方法分析板间变异样品，并采用 200 SPD 方法分析所有其他样品。EV1107 色谱柱（Evosep）在室温下操作，用于在 timsTOF HT 质谱仪（Bruker）上进行的所有实验，默认采用“短梯度直径-PASEF MS 方法”。使用无库模式的 DIA-NN（版本 1.8.1）与人类蛋白质组数据库（Uniprot，2020 年 10 月，20,600 个无亚型条目）进行数据分析，胰蛋白酶/P作为蛋白酶，允许2次遗漏切割。分析时，对所有条件进行单独搜索，并在同一条件下进行的重复实验启用运行间匹配。

图 1：Biomek i5 自动化移液工作站台面布局图以及基于每个工作流程处理 1-6 块板时每份样品所花费时间的通量示意图。

利用 Bioshake 振荡模块在 37 °C下过夜消化酶解，以确保最佳消化酶解效果，并使用密封盖密封以防止样品蒸发，并获得实验数据。该实验同样适用更短的消化酶解时间。我们处理了一个具有两种不同 HeLa起始量和两种空白类型的样品板，结果发现未出现交叉残留污染，这一点可通过空白中忽略不计的信号强度加以证明。在 timsTOF HT上使用200 SPD方法进行质谱分析，当蛋白质上样量为1 μg时，我们从每份样品中鉴定出5,500个蛋白质，上样量为500 ng时，鉴定出4,900 个蛋白。

当处理6块上样量为1 μg HeLa的孔板时，未出现板间变异，蛋白质水平的高 Pearson 相关系数证明了这一点。此外，我们还观察到高效、可重复的消化酶解过程，以及在所有工作流程中，蛋白水平中位变异系数（CV）均低于 20%。Evosep技术与Biomek i5自动化移液工作站的全面整合，无缝集成了可扩展的样品制备和 LC-MS 分析工作流程，确保获得可重复的高质量结果。

图 2：PAC HeLa 板（80% 上样和 200 SPD 法）的总信号强度和 6 块板（40% 上样和 500 SPD 法）的蛋白 Pearson 相关系数热图。采用 200 SPD 法分析的工作流程的消化酶解效率和蛋白组 CV。

非靶向血浆蛋白质组学在监测疾病发生和进展相关的临床研究中应用前景巨大。Evosep配备移液吸头形式的一次性捕获柱，是处理血浆等具有挑战性的样品类型的理想平台。因此，本文所描述的纯血浆分析和Mag-Net富集工作流程，可为大规模生物医学应用提供强大的分析利器。

为了证明工作流程的有效性，我们使用1 μl血浆制备了40份纯血浆样品，并使用4 μl血浆初始量制备了40份Mag-Net 富集样品。纯血浆分析表现出出色的分析深度，采用标准200 SPD方法鉴别出500种蛋白。

Mag-Net富集分析成功压缩了动态范围，采用200 SPD方法鉴别出2,700种蛋白，是纯血浆分析蛋白鉴别数量的 5 倍以上。在已鉴别的蛋白中，有40 种已在Vesiclepedia数据库中列出，其中多数蛋白CV 均低于20%，验证了该工作流程的有效性。最后，我们分别选择了一种高丰度血浆蛋白（ALB）、一种 EV 标志物（CD63）和一种已知的癌症生物标志物（ALDOA），并绘制了这三种样品在两种分析条件下所有40次重复的丰度。重复结果间的高度相似性表明，全面集成解决方案可跨重复的工作流程实现稳健可靠的实验结果。

图 3：纯血浆（1 μl，40% 上样）和 Mag-Net 血浆（4 μl，80% 上样）的动态范围。蛋白组 CV 与丰度以及丰度与所选蛋白分布的散点图。采用 200 SPD 法分析样品。

Biomek i5 自动化移液工作站与 Evosep 技术的完美融合，为高通量蛋白质组学分析领域带来了前所未有的强大且灵活的解决方案。我们的自动上样、PAC 消化酶解、纯血浆分析和 Mag-Net 富集分析等自动化工作流程，充分展现了其卓越的实验通量、重现性和分析深度。这些自动化工作流程极大减少了人工干预，大幅降低了成本，帮助用户轻松处理同类样本的大队列研究，因而成为常规分析和大规模研究的首选平台。通过将尖端自动化技术与液相色谱技术的全面融合，我们的解决方案充分满足了市场对标准化和可扩展蛋白质组学方案日益增长的需求。这些方案为临床研究和工业应用中追求高质量蛋白质组学研究的客户，开辟了一条更加宽广的科研道路。

Biomek 自动化移液工作站和Evosep One 仪器仅供研究使用，不用于临床诊断。

参考文献

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