干货：利用光遗传方法对 Cav1.3 通道研究的全过程

优 势

材 料

方 法

光遗传学的一个强大应用是利用光敏驱动器控制 Vm。在本研究中，C. reinhardtii 的光敏 ChR2 蛋白被用于控制 Vm，作为对状态依赖性 Ca_v1.3 阻断剂的高通量分析检测的基础。具体地说，ChR2_D156A 突变体在 FLIPR 系统上被其 LED 所发出的蓝光 (470 nm) 激活，这使得由于其对 Na⁺ 的渗透性和开放状态下约为 6.9 分钟的延长的时间常数^[3]，导致了一种超强的且被延长的膜去极化。由于 Vm 的去极化，Ca_v1.3 通道首先打开允许 Ca²⁺ 离子进入细胞（图 1），并随着时间的推移进入失活状态（图 2）。使用 FLIPR 钙 6 检测试剂盒观察细胞内钙离子的动态变化。

结 果

通过用 FLIPR 膜电位染料孵育 ChR2 转染的 HEK-293 细胞，验证了光激活 ChR2 对膜电位的调控。由 FLIPR 系统 LED 发出的蓝光脉冲导致膜去极化，而 FLIPR 膜电位染料的信号增加了 3 倍（图 3A）。随着时间的推移，膜电位信号的记录显示，当细胞膜重新极化时，从Z初的蓝光刺激到大约 30 分钟后，荧光信号返回到背景水平。这一数据表明，当蓝色光刺激 ChR2 打开时，Vm首先被去极化，随着时间的推移，ChR2 通道关闭 Vm 重新极化（图 3B），它的时间常数为 6.9 分钟。

转染的 HEK-293 细胞与 FLIPR 钙 6 染料孵育。随着钙离子进入细胞（图 4A），蓝色发光二极管发出的光脉冲触发了荧光信号的增加。随后的实验（图 4B）中，使用双脉冲检测方案的细胞来识别 Ca_v1.3 通道从失活状态恢复的时间依赖性。10 分钟间隔后，记录到了原始钙流一半的信号。45 分钟间隔后，几乎 100% 的信号被记录下来。数据显示，在第一次光脉冲 10 分钟后，一半的通道仍处于失活状态，从而产生 50% 的Z大钙信号。

用 K⁺ 调控 Ca_v1.3 通道的状态，转染 HEK-293 细胞系中加载 FLIPR 钙 6 染在 37 °C下孵育一小时，添加缓冲液增加钾离子浓度从 4 mM 到 75 mM 以形成不同的膜电位 (Vm)。然后在 FLIPR 系统中检测钙信号时添加 75 mM 的高浓度 K⁺。代表性的钙信号响应如图 5A 所示。K⁺ 依赖的失活曲线展示了与 K⁺ 浓度对应的 FLIPR 钙 6 染料信号，数据显示诱发的 50% Z大 Ca²⁺ 信号的钾离子浓度是 22 mM（图 5B），这表明在添加了此浓度的钾离子条件下有一半的 Ca_v1.3 通道处于失活状态。

依拉地平是一种抗高血压药物，它也可能有助于减缓帕金森疾病症状的发展，因其对 Ca_v1.3 的状态依赖性影响而被选为这项研究的对象。采用 ChR2 的光遗传学检测方案，表达了 Ca_v1.3 的 HEK-293 细胞在添加不同浓度依拉地平的情况下，用 FLIPR 钙 6 染料在 37 °C 下孵育一小时。在 FLIPR 系统上采用蓝色光脉冲进行刺激，检测到通道关闭状态下钙流荧光信号的强度的增加。10 分钟后，给予了第二次蓝色光脉冲刺激，记录到了通道失活状态下钙流荧光信号的变化。仅观察到原始钙流信号一半强度的荧光信号。在图 6A 中，结果显示为 Ca_v1.3 通道效应的 %。高 K⁺ 调控方案记录的依拉地平的 IC₅₀ 曲线如图 6B 所示。在较早的钾离子调控实验基础上，将 4 mM K⁺ 或 22 mM K⁺ 添加到 FLIPR 钙 6 染料的加载缓冲液中，分别诱导关闭和失活状态。在 FLIPR 系统中检测钙信号时添加了 75 mM K⁺。膜片钳方法下检测的 Ca_v1.3 通道关闭和失活状态下依拉地平的 IC₅₀ 曲线如图 6C 所示。

总 结

包括膜片钳结果在内的所有 Ca_v1.3 通道关闭和失活状态下依拉地平的 IC₅₀ 值的比较如表 1 所示。与关闭状态下的值相比，所有检测方法下得到的在失活状态下的 IC₅₀ 值的左移大约为 10 倍。这很重要，因为对离子通道的复合效应在通道关闭和失活状态下可能具有不同的临床意义。通过光遗传学检测方案，IC₅₀ 值更接近于以电生理方法获得的 IC₅₀ 值。光遗传学所获得的“阻断比例”值与电生理学方法所获得的值高度相似，从而提示其高生物相关性。与电生理学不同的是，光遗传学检测中的细胞在实验结束时完好无损。此外，光驱动的光遗传检测是可逆的，这是灵活的分析方法的一个非常理想的特性。

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