多因子实验操作二三事，轻松get高通量数据！！！

使用多因子免疫分析进行多种分析物检测已被证明是用于全面的生物学系统研究的宝贵工具。这些系统由分泌型蛋白网络组成，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和其他蛋白质，多重免疫分析是一种高效的方法，可用于较少样本中大量蛋白质的生物标志物图谱分析。

Invitrogen? ProcartaPlex?多因子免疫分析是基于Luminex? xMAP?技术的蛋白定量分析。

ProcartaPlex特点：所需样本量少，工作效率更高，操作类似传统ELISA，Z多可以一个样品检测80种靶标。

对于多因子检测的实验步骤，大致实验流程如下：

• 新鲜样品如果不能在24h内检测，需要分装在-80 ℃保存，切忌反复冻融。否则如果冻融次数多了，蛋白会有不同程度的降解。

• 热灭活对蛋白检测结果也有影响，各种待检测因子的热稳定性不同，蛋白很可能会变性。

• 血浆样品：根据实验需求选择柠檬酸或EDTA作为抗凝剂。如果选择肝素作为抗凝剂，建议每毫升血不超过10IU肝素（肝素用量过高，可能会导致部分检测指标值偏高）。

• 样品从冰箱取出来融化后务必要10000g 离心5-10min。冷冻过的样品中可能会有沉淀或脂类物质存在，离心去掉这些杂质是为了保证抗体的孵育过程，也为了避免堵塞Luminex仪器管路，而离心步骤并不会影响抗体间的结合。

• 此操作过程尽量让试剂保持在冰上。

• 溶解标准品前，先对标准品管子进行快速离心，确保标准品干粉都聚集到管底，溶解的时候一定要把管子倒转，使得盖子上残留的干粉也能被溶解充分。

• 梯度稀释标准品的时候从高浓度向低浓度取液时，一定要更换枪头，不要始终使用同一个枪头，这会影响标准品梯度浓度准确性。

• 用移液器吹打混匀的时候一定要慢，尽量不要有气泡产生，气泡产生会使蛋白容易降解。

• 移液器吸液要慢，打出液体的时候，不要一次全打出，待液体剩10ul左右稍停一会，等枪头内壁上的液体流到枪头处，即可一次打出。这样可以避免因枪头内有残留导致结果不准确。

• 加Beads之前一定要充分涡旋混匀，Beads是有一定重量的，在储存、放置状态下会沉降、聚集发生黏连，对后续的孵育有很大影响，涡旋可以使beads被充分散开、混匀。

• Beads混到一起倒到加样槽里，用排枪每次取液前务必要轻柔吹打混匀5-6次，如果混悬不充分有可能导致有些孔Beads数不够甚至没有，影响实验结果。

• 保证加样要准确(移液器准确，用枪习惯标准)，加样时杜绝其他干扰，避免加错孔。

• 每次取样需要更换新的枪头

• 样品若未充分离心去除杂质，取样时注意不要吸到沉淀或脂类物质，当检测样本要做复孔甚至三孔重复时，每次取样的位置应该尽量一致。因为取样的位置不一样，也可能会引起检测结果差异比较大。

• 孵育磁珠后的洗涤步骤，必须将96孔板固定到磁板上，一定要确保板底贴着磁板，96孔板的侧边也要确保与磁板固定牢靠。

• 清洗后把液体甩掉时，96孔板保持在磁板上，不要取下，手拖着磁板，迅速把磁板倒扣过来平着向下用力压并迅速停住，依靠惯性，孔中液体会甩入废液桶，（注意废液桶不要与孔板距离太近，避免飞溅起来的废液污染孔中样本），然后切记不要将磁板立刻翻转回来，而是顺势把磁板倒扣在吸水纸上，让残留液体被吸水纸充分吸干。切记这步甩掉液体后，磁板不要立刻反过来，而是必须直接扣在吸水纸上。否则孔的边缘残留的液体在翻转的过程中有可能造成孔间交叉污染。

• 液体甩掉以后可以观察下每个孔里是否都有磁珠，确保这个过程没有丢失大量磁珠，正常状态下磁珠被磁板吸附在孔底，肉眼可见一团聚集的磁珠。

• 如果样品性状是比较粘稠的，必须多洗几次，以确保洗涤充分

• 甩掉液体后一定要确保孔中液体不要被晾干，否则会引起背景增高，所以需要确保在甩掉液体前，提前把下一步要加的液体准备好，避免甩掉液体之后再配液体，而造成等待配液时，孔内被晾干。

• 为了能够清洗得更彻底，这步洗涤必须把96 孔板从磁板上拆下来，加了洗液后，再放到磁板上静置2min，孵育后再用上述的方式甩掉液体，并重复。

• 洗涤Z后一次甩掉液体后，扣在吸水纸上可以多扣一会，保证把孔里的液体清除得更彻底，但依然要保持孔中不会被晾干。

• 读板前需要将96孔板充分震荡（500 rpm 室温下震荡5min），然后立即上机检测。如果不能立即上机检测，可待到能够读板前，再充分震荡后进行读板，否则Beads聚集在板底，不能被仪器正确读取。

• 如果当天做完了不能上机检测，可以用封板膜封板后放4度避光保存，第二天换上新的Reading Buffer，并充分震荡后再读板。

• 如果当天做不完，可以在加完样品和标准品后，500rpm 室温下震荡孵育30 min，再放置于4度静置过夜。第二天取出，500rpm 室温下震荡孵育30 min，再继续往下操作。

特色靶标展示：