干货 | 蛋白表达第一弹-质粒提取

利用重组DNA或RNA获得目的蛋自的技术，其原理是将外源基因与载体连接成重组载体，然后转入到宿主菌从而表达目的蛋白。

基因克隆 → 载体构建 → 转化/转染 → 诱导表达 → 蛋白提取 → 纯化 → 鉴定

目的：将目标基因插入表达载体，获得重组质粒。
操作：
1)设计引物（含酶切位点或同源臂）
2)PCR扩增目的基因
3)双酶切或同源重组连接载体
4)转化大肠杆菌DH5α，涂板筛选
5)菌落PCR、酶切鉴定、测序验证

原核表达（IPTG诱导）
1)小试优化：设置IPTG浓度梯度（0.1-1 mM）、温度梯度（16-37℃）、时间梯度（2-16 h）
2)SDS-PAGE检测：确定最佳表达条件

真核表达
1)瞬时转染：质粒在细胞中暂时表达，48-72 h后收蛋白
2)稳定细胞系筛选：加抗生素（G418/嘌呤霉素）筛选2-4周
3)诱导型启动子：如Tet-On系统需添加诱导剂

?? 关键 ：全程4℃操作，充分添加蛋白酶抑制剂（PMSF、Cocktail）

蛋白纯化基于分子间相似性与差异，主要采用层析、沉淀及过滤技术。

策略建议：根据目的蛋白的稳定性、标签类型及理化性质，优先选择亲和层析快速捕获，再辅以离子交换或凝胶过滤精纯，沉淀法常用于初始浓缩。

选择建议：纯化蛋白首选A280快速检测；粗提液或含去垢剂样品推荐BCA法；高通量筛选用Bradford法；微量样品选荧光法。

质粒作为携带目的基因的表达载体，其设计直接决定了蛋白表达的成败。强启动子（如T7/lac）驱动转录效率、抗性基因保障筛选稳定性、亲和标签（His/GST）简化后续纯化、密码子优化提升翻译水平——这些元件的精密组合，构成了蛋白表达的"蓝图"。一个优质的质粒，既要具备高拷贝数以获得基因剂量优势，又要保证复制稳定性避免宿主负担过重。

质粒提取绝非简单的"提DNA"操作，而是整个蛋白表达流程中承上启下的关键环节。提取产物的质量直接决定了下游实验的成败：纯度不足（残留内毒素、RNA或基因组DNA）会抑制宿主细胞生长甚至导致表达沉默；浓度不够则影响转染效率；而质粒降解更是断送了所有后续努力。许多研究者遭遇的"转化失败""表达量低""蛋白无活性"等问题，根源往往回溯到这第一步操作。可以说，质粒提取的质量，为整个蛋白表达项目定下了基调。

针对这一关键环节，翌圣生物提供从质粒提取到蛋白表达的全流程优化方案。其质粒小提/中提/大提系列试剂盒采用改良的裂解-中和-纯化技术，内毒素残留低于0.1 EU/μg，A260/A280比值稳定在1.8-2.0之间，确保质粒的高纯度与完整性。我们拥有蛋白制备研究的整体解决方案，包括载体构建、蛋白表达、蛋白纯化、蛋白分析，为您的研究保驾护航。