胶带剥离与冷冻切片组合技术如何助力离体人体皮肤药物组织分布实验

在制药研发领域，准确把握药物经皮渗透规律与皮肤层内分布特征，可为配方优化、渗透机制研究及临床风险评估提供重要数据支持。本文将详细介绍一套经优化的体外研究方法，该方法结合胶带剥离与冷冻切片技术，并通过红外光密度测定，可精准分析药物在角质层（SC）和深层皮肤组织（deeper skin layer）中的分布情况，为药企研发人员提供实用的实验指导。

皮肤作为人体最大的器官，既是药物经皮给药的重要屏障，也是药物发挥局部或全身作用的关键靶标。过去几十年间，众多研究方法被开发用于探究药物的经皮转运（渗透，permeation）和在不同皮肤层中的分布（浸透,penetration）。这些数据对于药物侵袭性评估、生物利用度测算、安全性评价以及化学品风险评估等实验而言，具有非常大的价值。

对于正确研究药物皮肤深度分布，有两个关键数据：第一，需要知道每个样本剥离的皮肤角质量；第二，要知道每个样本中所含药物的量。根据这两个数据，可以计算出角质层深度和归一化药物浓度（样本单位皮肤体积中的药物量）。

传统上，剥离深度是通过胶带粘贴次数来确定的。人们曾假设，重复粘贴胶带可能会去除恒定数量的角质层，与已经粘贴的次数无关。因此，每次的胶带剥离深度可以通过将角质层总平均厚度除以胶带总数量来计算。但实际研究表明，最初的胶带粘贴去除的角质量比后续的胶带粘贴要多。因此，这一假设的有效性受到了质疑，并引入了相关替代方法：例如通过称重差异或蛋白测定法（BCA）来单独测定每个胶带粘贴上的角质层量。但这些方法耗时，并且（在后一种情况下）具有破坏性。因此，无法在同一条胶带上确定药物量和角质层中的深度。 

为此，本文介绍的优化方法应运而生。方法通过结合红外光密度测定（IR-D）和冷冻切片技术，可高效获取药物在皮肤各层的浓度 - 深度分布曲线，为药物配方筛选、渗透动力学研究提供可靠的数据支持。

准确测量皮肤总厚度和角质层厚度是后续实验的基础。皮肤总厚度测量采用卡尺法：将皮肤样本置于载玻片上，覆盖盖玻片后，使用经校准的卡尺在 5 个不同位置进行测量，取平均值作为总厚度。这种方法操作简单，能快速获取整体皮肤厚度数据。

角质层厚度测量则需结合组织切片与显微镜技术。具体步骤为：取 4mm 直径的皮肤活检样本，经 Tissue-Tek? 包埋后，用冷冻切片机切成 10μm 厚的切片；切片经苏木精染色增强对比度后，使用配备刻度标尺和图像分析软件的光学显微镜（400×）进行观察，在至少 10 个不同区域测量角质层厚度并取均值。该方法可精准区分角质层与其他皮肤结构，确保厚度数据的特异性。

胶带剥离技术是分离角质层的金标准，其原理是利用胶带的粘性逐层去除角质层细胞及细胞间脂质。本研究采用的方法有效提升了实验的标准化程度。由可固定的压模、含 cork 圆盘的铝块和 2kg砝码组成，配合15mm 直径的聚四氟乙烯掩膜，可精确定义剥离区域（面积约1.77cm2）。

将剥离胶带裁剪为 19×19mm 规格。操作流程严格规范：皮肤样本固定于 cork 圆盘后，每次将胶带中心对准剥离区域，施加 2kg 压力保持 10s，随后快速揭下胶带。通过850皮肤角质量测试仪测量达到定量下限（LLOQ）后，即胶带吸收值降至空胶带 5 倍背景噪音水平，此时判定角质层已完全去除。

红外光密度测定在剥离后立即进行，通过校正空胶带背景吸收（xi = xi* - x0），可量化每个胶带样本上的角质量。该方法具有快速、非破坏性优势，已通过与 BCA 蛋白测定法的相关性验证，确保数据可靠。

去除角质层后的剩余皮肤需进行冷冻切片以研究深层皮肤（DSL）的药物分布。样本经二氧化碳快速冷冻后，用 13mm 直径打孔器获取活检组织，通过自制铝制冷冻块固定于冷冻切片机。切片方向平行于皮肤表面，厚度设定为 25μm，按预设方案合并为不同样本组（如 “#7 组：2 个切片，#8组：4 个切片” 等），并称重记录。

冷冻切片技术的关键在于快速冷冻以阻止药物扩散，同时通过精确控制切片厚度和方向，保证深层皮肤层划分的准确性。二氧化碳冷冻因速度快成为首选，但需注意不适用于挥发性药物。

药物提取效率直接影响结果准确性，需根据药物性质选择合适的提取介质。实验建议通过质量平衡验证提取效果：对所有接触药物的装置部件进行提取，确保总回收率在 85%-115% 之间。提取流程包括：样本中加入 2mL 提取介质，振荡 2h 后，以 5000rpm（800×g）离心 30min，取上清液进行定量分析（如 HPLC）。

提取介质的选择需避免溶解胶带胶黏剂或皮肤成分，以防干扰色谱分析或损坏仪器。对于胶带样本，可加入玻璃珠防止胶带粘连，进一步提升提取效率。

1.皮肤样本处理：推荐使用腹部整形手术获取的皮肤，需签署知情同意书；样本在 - 26°C 储存不超过 6 个月，避免反复冻融；皮下脂肪组织不得接触角质层，以防脂质污染。

2.操作规范：胶带需用镊子夹持非测量区域，避免污染；剥离压力严格控制为 2kg，时间为10秒，确保每次操作一致性；冷冻切片前需确认皮肤表面平整，提升切片质量。

3.安全与质量控制：生物样本操作需遵守安全规范；提取介质需验证无干扰；实验记录应包括皮肤捐献者信息、储存时间等关键参数，保证结果可追溯。

4.特殊情况处理：水性介质可能导致表皮脱落，需缩短孵育时间；挥发性药物避免使用二氧化碳冷冻；样本可在 - 26°C 短期储存，但需尽快提取分析。

本方法通过整合胶带剥离、冷冻切片和红外光密度测定技术，实现了药物在皮肤各层分布的精准分析，可为制药研发提供多方面支持：

?配方优化：比较不同载体对药物皮肤分布的影响，指导制剂处方设计；

?渗透动力学研究：通过不同孵育时间点的 profiles 分析，阐明药物穿透规律；

?安全性评估：检测药物在皮肤中的蓄积分布情况，评估潜在安全性风险；

?机制探讨：揭示药物渗透路径（如细胞间 vs 细胞内）及蓄积形成机制。

随着经皮给药技术的发展，该方法有望进一步与成像技术（如 Raman 光谱、质谱成像）结合，实现更高分辨率的药物分布分析。同时，标准化操作流程的建立将提升不同实验室间数据的可比性，推动经皮给药研究的规范化发展，为创新药物和制剂的开发提供有力的实验工具，助力提升药物研发效率与质量。在实际应用中，需根据具体药物特性灵活调整实验参数，确保方法适用性，最终为临床用药安全有效提供科学实验证据。

参考文献

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