脑切片能量代谢临界状态：氧气输送和能量底物在塑造神经元活动中的主要作用

研究简介:在完整的脑中，存在一个复杂的系统来协调能量底物的输送，并根据神经元的能量代谢需求调整能量底物池的组成。然而，在体外的脑切片实验中，这种复杂的系统并不存在，神经元的能量供应完全依赖于实验条件。因此，确保实验条件尽可能接近体内情况是体外研究的首要要求，其中氧气供应是关键因素之一。标准人工脑脊液（ACSF）中仅含有葡萄糖作为能量底物，但体内脑组织中的能量底物池可能更为复杂，包括乳酸等其他底物。本论文主要研究了脑切片中能量代谢的临界状态，重点探讨了氧气输送和能量底物在塑造神经元活动中的关键作用。研究人员使用了P19至P44的瑞士小鼠海马脑切片。通过施加不同频率的刺激，记录局部场电位（LFPs）和NAD(P)H荧光变化，同时测量切片组织中的氧分压（pO2）。实验中，通过改变灌流速率（4ml/min和15ml/min）来研究氧气供应对神经元活动的影响，并比较了在标准ACSF和富含能量底物的ACSF（eACSF，包含葡萄糖、丙酮酸、β-羟基丁酸等）中的神经元活动和能量代谢。本研究表明，脑切片中的神经元活动和能量代谢对氧气供应极为敏感，且在高氧气供应下，其他能量底物可以增强神经元的氧化代谢和功能。然而，在氧气供应不足时，这些底物的效果大打折扣。因此，在体外脑切片实验中，确保充足的氧气供应和合理选择能量底物对于模拟体内神经元活动至关重要。

Unisense微电极系统的应用

Unisense微电极被用于测量脑切片组织中的氧分压（pO2）。具体使用的是Clark式氧气微电极，其尖端直径为10微米。该微电极连接到PA2000主机上，用于精确测量切片组织中的氧气浓度。使用了两点校准法，将电极插入33°C的生理盐水溶液中，分别在95%氧气或环境空气中平衡，以校准电极。氧气微电极被放置在与场电位记录电极相近的位置，用于测量局部组织氧分压的变化。通过Unisense微电极，研究人员能够实时、高精度地测量切片组织中的氧分压，采集到的数据用于分析氧气供应对神经元活动的影响，特别是在不同灌流速率下氧气分布的变化。

实验结论

研究结果证实，在急性脑组织切片中，决定神经元兴奋性的基本神经元参数与氧化能代谢密切相关。我们还表明，能量代谢状态对切片组织中氧气的可用性高度敏感。这个ATP合成途径在脑组织切片中显然受到了损害，因此神经元活动对氧浓度的依赖性明显转向了更高的氧分压值。此外，在神经元活动期间，葡萄糖可能无法完全满足神经元的能量需求，因此还需要其他与葡萄糖互补的能源物质来为氧化代谢提供充分的支持。鉴于在众多电生理学研究中，切片中的氧分压以及脑灌注液中的能量物质组成均未得到控制。

图1、灌流速率对切片氧分压和LFP幅度的影响。A）氧分压深度分布，(a)：展示了在15ml/min和4ml/min灌流速率下，脑切片中的氧分压深度分布。图中灰色条表示切片的位置。在15ml/min时，切片核心的氧分压约为300Torr，而4ml/min时，切片核心的氧分压急剧下降。(b)在CA1区记录的LFPs，由单次刺激Schaffer collateral（SC）引起。LFPs的幅度在15ml/min时显著高于4ml/min。(c)统计总结了不同灌流速率下LFP积分值的变化。15ml/min时的LFP积分值显著高于4ml/min。B）双层灌流室中的氧分压。C）阿登苷酸受体拮抗剂DPCPX对LFP的影响。

图2、刺激协议中的局部场电位和氧分压动态。A.氧分压和LFPs的同步记录。展示了在15ml/min灌流速率下，通过一系列单次SC刺激（1/7s）激活神经元后，30秒10Hz刺激引起的氧分压和LFPs的动态变化。B.氧分压和LFPs的时间过程。展示了氧分压和LFPs随时间的变化过程，进一步说明了两者之间的相关性。

图3、不同灌流速率下的氧分压、NAD(P)H信号和LFPs。A）氧分压和NAD(P)H自荧光。展示了在15ml/min和4ml/min灌流速率下，氧分压和NAD(P)H自荧光的变化。B）LFPs在刺激训练中的变化。展示了在不同灌流速率下，LFPs在30秒10Hz刺激训练中的变化。C）LFPs积分值的比较。展示了不同灌流速率下，LFPs积分值的变化。在4ml/min时，LFPs积分值显著下降。

图4、4-AP诱导的同步网络活动对灌流速率的依赖性。展示了在不同灌流速率下，4-AP诱导的同步网络活动的LFPs和氧分压的变化。

图5、在充足氧气供应下，富含能量底物的ACSF增强氧化代谢和突触功能。A）氧分压和NAD(P)H瞬态以及LFPs，展示了在富含能量底物的ACSF（eACSF）中，30秒10Hz刺激引起的氧分压和NAD(P)H自荧光的变化，以及LFPs的动态变化。B）LFPs积分值，展示了在eACSF中，LFPs积分值的变化。在eACSF中，LFPs的幅度显著增加。C）氧分压和NAD(P)H信号参数。展示了在eACSF中，氧分压和NAD(P)H信号参数的变化。

结论与展望

大脑中的血管-神经-神经胶质相互作用系统能够控制大脑的能量供应，而在培养皿中这一系统是不存在的，因为能量供应是由实验条件决定的。尽管神经元活动极其耗能，但关于浸没脑切片中的能量代谢状态却鲜有报道。由于缺乏这些信息，随意选择的氧合和代谢条件使得在切片中的有效氧化代谢变得不可靠。研究表明，在小鼠海马切片（出生后第19-44天）中，诱发的神经元放电、自发的网络活动（由4-氨基吡啶引发）以及突触刺激诱导的NAD(P)H胞质荧光强烈依赖于氧气供应情况。只有当灌注速率高达约15毫升/分钟（95%氧气）时，才能为切片提供适当的氧气供应。较低的氧合会导致局部场电位和自发网络活动的减少，以及短期突触可塑性的显著调节。氧气供应的减少显著抑制了NAD(P)H信号的氧化阶段，表明神经元活动的变化与有氧能量代谢的减少是平行的。与体内条件相比，神经元活动对氧张力的依赖性在切片中明显向更高的氧浓度方向转移。高灌注率提供的充足的氧气量、将脑灌注液中的葡萄糖部分替换为β-羟基丁酸、丙酮酸或乳酸，都能增强氧化代谢和突触功能。这表明大脑中高氧含量是维持氧化代谢的必要条件，而仅靠葡萄糖无法满足神经活动期间的能量需求。研究结果表明，能量代谢决定了神经网络的功能状态，这突显了在体外实验中必须确保提供充足的代谢支持。