ADC药物由抗体、连接子和细胞毒性药物组成,其独特的结构使其在肿瘤治疗中展现出巨大的潜力。
然而,ADC药物的生产过程中,纯化是关键环节之一,它直接影响产品的质量、安全性和有效性。
不同代次的ADC药物,由于其制备工艺和结构的不同,所需的纯化方式也有所差异。深入了解各代次ADC药物的纯化方式,对于优化生产工艺、提高产品质量具有重要意义。
第一代ADC药物的纯化方式
第一代ADC药物多采用随机偶联的方式,导致产品异质性较高,混合物中含有不同药物-抗体比(DAR)的ADC以及未反应的抗体和药物等杂质。因此,其纯化的主要目标是分离出具有特定DAR的ADC,并去除杂质。
疏水层析(HIC)是基于分子疏水性的差异进行分离的色谱技术在第一代ADC药物纯化中应用广泛。如Matsuda等人[1]使用HIC对基于AJICAP第一代技术制备的ADC药物进行纯化。
通过优化流动相条件和填料,选用合适的HIC填料,以pH 7.0的50 mM磷酸钠、2 M氯化钠为缓冲液A,pH 7.0的50 mM磷酸钠、20%异丙醇(IPA)为缓冲液B,实现了对不同DAR物种的分离,成功获得了 “DAR=1.0” 和 “DAR=2.0” 的纯化产物,且回收率较高。
HIC能够有效分离不同DAR的ADC,但其分辨率相对较低,对于结构相似的杂质分离效果有限。
图1总结了现有HIC填料的配基种类与疏水性排序,需要指出的是,填料的疏水性强弱并非绝对,有时会因为项目分子的性质差异而存在细微差别。
图1: HIC填料配基与产品疏水性排序
超滤/透析(UF/DF)技术常被用于去除ADC偶联过程中添加的小分子杂质和缓冲液成分 。
在ADC药物研发中,在一些ADC药物的纯化工艺中,首先利用HIC根据分子疏水性差异分离出不同DAR值的ADC粗产品,然后通过UF/DF技术,选择合适截留分子量的膜,去除残留的小分子杂质和缓冲液成分。
在这个过程中,UF/DF技术不仅能够有效去除杂质,还能在一定程度上控制产品的药物-抗体比,确保产品质量均一。但是需要注意的是,ADC偶联过程的UF/DF工艺与抗体纯化过程的UF/DF工艺参数不尽相同,如下表所示,汇总整理出两者工艺的差别[2]。
表1:Comparison of Key UF/DF Processing Parameters between mAbs and ADCs
第二代ADC药物的纯化方式
随着技术的发展,第二代ADC药物开始注重特异性位点偶联,以减少产品的异质性。这一代的纯化方式在延续第一代方法的基础上,引入了一些新的技术,以更好地满足对高纯度、高活性产品的需求。
第二代ADC药物纯化中,HIC仍然发挥着重要作用。一些研究[3]通过进一步优化HIC的条件,提高其分离效果。同时,HIC与其他技术联用也成为趋势,例如在分析ADC药物时,将HIC与RP-HPLC、MS等技术结合,可以更全面地对ADC进行表征和纯化。
阳离子交换层析(CEX)是一种利用离子交换剂的电荷特性进行分离的层析技术,其纯化实现了THIOMAB平台的ADC药物的分离纯化[4]。
THIOMAB平台偶联后中存在残留的未配对半胱氨酸,导致出现明显的电荷异质性区别,从而可以使用SP Sepharose High Performance进行分离纯化以得到想要的ADC药物。
从上述介绍我们可以发现,阳离子在ADC工艺中,去除小分子杂质和聚集体方面有非常重要的作用,常用的阳离子层析填料有Capto S ImpAct和Capto SP ImpRes,都可以有非常好的效果。
第三代ADC药物的纯化方式
第三代ADC药物追求更高的均一性、稳定性和靶向性,其纯化方式也更加多样化和精准化,以满足对复杂结构和高质量要求的产品的纯化需求。
利用抗原-抗体的特异性相互作用的原理,开发了基于亲和作用的纯化技术。例如使用Protein A亲和层析介质[5],可以特异性地结合ADC中的抗体部分,实现对ADC的高效纯化。
这种方法具有高选择性和高回收率的特点,能有效去除杂质,得到高纯度的ADC产品。具有丰富的protein A亲和层析介质可供大家进行选择,如下图。
图2:具有的protein A亲和层析填料
膜层析具有传质速度快、分离效率高、可放大性好等优点,在第三代ADC纯化中得到应用。
在某些研究中,使用膜色谱进行ADC的纯化,能够快速分离出目标产物,减少杂质的残留。与传统的柱色谱相比,膜色谱更适合大规模生产,且能减少样品在纯化过程中的损失和变性。
来自PALL的阳离子膜层析Mustang S可供选择,膜材是亲水性的聚醚砜,孔径0.65 μm,膜上连接有强阳离子S配基,由16层膜构成,是ADC纯化中的有力工具。
图3:Mustang S膜层析型号及对应体积
复合模式层析是利用一种以上相互作用的模式,彼此单独或者协同进行分离的层析方式。
在Keller等人的研究中[6],研究选用了两种DAR值分别为2和8、等电点均为9.1的ADC分子进行实验。
实验过程中,选用了五种混合模式填料进行筛选纯化 ,并分别得到合适的复合模式填料,依据梯度洗脱试验结果,将梯度洗脱优化为分布洗脱,最终得到纯净的单峰,实现了对ADC药物的有效纯化。
该案例充分展示了混合模式色谱法在ADC药物纯化中的应用,通过筛选合适的填料和优化洗脱条件,可以实现对目标ADC分子的高效分离和纯化。
图4:Overall process flow diagram
不同代次的ADC药物纯化方式随着技术的进步不断发展。在未来,ADC药物纯化技术的发展:
将更加注重提高产品质量、降低成本、适应大规模生产以及满足临床需求;
进一步优化现有纯化技术,开发新的纯化方法;
以及实现多种技术的联用,将是未来ADC药物纯化领域的研究重点。
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