PCR的反应动力、循环参数及临床应用

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的Zda特点，是能将微量的DNA大幅增加。

PCR的反应动力学

DNA扩增量随着PCR的三个反应步骤的重复循环进行而呈指数级增长。实际反应初期，靶序列DNA片段呈指数级增加，当PCR产物的逐渐积累时，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，此时进入线性增长期或静止期，使得平均效率达不到理论值。

循环参数

预变性

PCR能否成功至关重要的因素为模板DNA是否完全变性与PCR酶是否完全激活。建议参考试剂说明书来决定加热时间，通常未修饰的Taq酶激活时间为2min。

变性步骤

通常温度为95℃，使各种靶DNA序列完全变性所需的时间大概为半分钟，可能的情况下可以缩短该步骤时间。若变性时间过长，会对酶活性损害，若变性时间过短，则靶序列变性不彻底，可能导致扩增失败。

引物退火

需要从多方面来决定退火温度，通常是以引物的Tm值为参考，按照扩增的长度对退火温度进行适当的下调。之后在此次实验基础上做出预估。PCR的特异性受到退火温度的影响非常大。

引物延伸

引物延伸通常在72℃（Taq酶Z适温度）下进行。若退火温度较高并且扩增长度较短，那么可以省去本步骤。

扩增片段长短决定了延伸时间，通常推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

循环数

大多数PCR包括25-35循环，若过多容易有非特异扩增产生。

Z后延伸

在Z后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

临床应用

移植配型：

伴随着PCR技术的出现，HLA配型领域也引入了分子生物学技术，通过PCR扩增仪能够使得HLA基因分型方法快速、准确的建立，使临床移植配型得到满足。

诊断恶性肿瘤：

PCR技术不仅带来了简便快速、准确的临床诊断方法，而且提供了肿瘤相关疾病的ZL与预后的监控手段。其被用来检测肿瘤相关病毒基因以及癌基因和抑癌基因缺失与点突变。

诊断遗传性疾病：

遗传性疾病是以核酸的表达产物和核酸分子结构变异为发病基础的。对于这一类疾病，PCR技术正好是有效的检测手段。

诊断感染性疾病：

在感染性疾病的诊断方面，对于一些没有可靠和稳定的检测手段以及需要很长周期培养的病原体，PCR技术特别适合使用。