随机引物合成法的操作、注意事项和优点

分子杂交（molecular hybridization）是指使单链核酸碱基序列确定的技术。待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对使可检出的双螺旋片段形成为分子杂交的基本原理。下面就让小编带你了解一下双链DNA探针标记法中的随机引物合成法。

概念

将DNA模板和寡核苷酸引物结合经过Klenow酶的作用使得DNA探针合成，合成的DNA探针即为随机引物合成双链探针。反应中酶的量、dNTP、模板、引物对合成产物的大小、产量、比活性均会产生影响。产物的平均长度一般是400-600个核苷酸。

操作准备：

设备：恒温水浴锅、高速台式离心机等。

材料：待标记的DNA片段。

试剂：缓冲液A；[α-32 P] dATP；20mmol/L DTT；Klenow片段；10×随机标记缓冲液；随机引物。

具体操作：

混合1μl 7.5ng随机引物以及1μl 200ng双链DNA，然后将混合液放入eppendorf管中，先进行5min水浴煮沸，再立刻进行1min冰浴。将1μl ddH2O，3μl[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl)，1μl 10×随机标记缓冲液，1μl 未标记的dNTP溶液以及1μl 20mmol/L DTT在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合。在后管中移入前管中的溶液。将5单位Klenow片段加入到管中，充分混合,使用微型离心机通过12000g离心1-2秒, 从而使得所有溶液在试管底部沉着，室温环境中保温3-16h。将10μl缓冲液A加入到反应液中，在-20℃下保持放射性标记的探针以备使用，与此同时将放射比活性计算出来。

注意事项

1.模板DNA应当为线性的。

2.需要认真调整引物与模板的比例，如果引物比模板高，那么会得到较短片段的探针，然而累积较多的产物；相反，则反应产物比较长。

优点：

使用随机引物反应的优点如下：

1.在低熔点琼脂糖中，随机引物也能够直接进行反应。

2.反应产物具有比较到的比活性，比活性能够达到4×109 cpm/μg探针。

3.即使使用的质粒DNA模板微量也能够进行反应，其在反应时对模板没有较为严格的要求。

4.5'→3'外切酶活性不为Klenow片段所具备，能够稳定地进行反应，从而使大量的有效探针得以获得。