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聚焦层析亦是一种柱层析,所以,和其他的层析相同,其亦是将缓冲交换剂作为固定相,将缓冲剂作为流动相。能够从聚焦效应、蛋白质的行为以及pH梯度溶液的形成这三方面来对聚焦层析原理进行阐述。
1、蛋白质的行为
层析柱中的pH值以及蛋白质的等电点(PI)决定了蛋白质所带电荷。当蛋白质的PI超过柱中的pH时,蛋白质带正电荷,并且不会结合阴离子交换剂。随着洗脱剂向前移动,随着淋洗时间延长,固定相中的pH值会发生变化。当白质移动至环境pH高于其PI时,蛋白质由带正电变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。因为通过了洗脱剂,蛋白质周围的环境pH 发生变化,低于PI,其又带正电荷,并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移,将反复进行着上述过程,所以在各自的等电点洗脱下各种蛋白质,从而使得分离的目的达到。蛋白质不一样,具有的等电点等电点,离子交换剂与它们结合之前,有着不同的移动的距离,根据等电点排列洗脱出来的先后次序。
2、聚焦效应
聚焦效应是指pH梯度环境中,根据蛋白质的等电点对其进行排列的过程。聚焦效应是以pH梯度的形成为先决条件的。如果在已形成pH梯度的层析柱上加入一种蛋白质,因为洗脱液的连续流动,其将向着与它等电点相同的pH处迅速地迁移。从这个位置开始,蛋白质一直会通过缓慢的速度吸附、解吸附,一直到在等电点pH时被洗出。如果在析出此蛋白质样品之前,再将第二份同种蛋白质样品加入,那么在洗脱液的作用下,第二份同种蛋白质样品不被固定相吸附,会用相同的速度向前移动,一直到迁移至近似本身等电点的环境处位置,之后两份样品以同样的速度迁移。左后被同时从柱底洗出。实质上,同时从柱底洗出。分次加入一种样品时,只要还没有洗出先加入者,并且有一定的时间进行聚焦,那么还能够在柱上加入剩余样品,就能够顺利完成其聚焦过程,得到满意的结果。
3、PH梯度溶液的形成
在离子交换层析中,依靠梯度混合仪来使得pH梯度溶液的形成实现。当使用阴离子交换剂进行层析时,将高pH溶液装入梯度仪的混合室,而将低pH极限溶液装入另外一个室,之后将层析柱的下端出口打开,使得洗脱液从柱体连续不断地流过。此时从柱的上部到下部溶液的pH值的变化就是由高到低的。当洗脱液流进多缓冲交换剂时,因为具有缓冲能力的电荷基团为交换剂所携带,因此,能够自动形成pH梯度。
例如,当将作为固定相的阴离子交换剂PBE94装入柱中时,首先使用起始缓冲液将pH值平衡到9,然后再将从柱体通过含有pH值为6的用作流动相的多缓冲物质的淋洗液,此刻,在碱性阴离子交换对和多缓冲剂中酸性Z强的组分相结合发生中和。柱内每点的pH值随着不断加入淋洗液而逐渐下降。按照此方法处理一段时间后,pH6~9的梯度就从层析柱顶部到底部形成了。
聚焦层析柱中在淋洗过程中自动形成了pH梯度溶液,然而随着淋洗的进行,pH梯度会不断向下迁移,从底部流出液的pH由9至6Z后保持恒定,此时就不存在层析柱的pH梯度。
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