CCK-8 实验操作指南
1、实验目的与原理
用途：检测细胞活性（如药物处理后细胞存活率）。
原理：细胞内脱氢酶还原 CCK-8 试剂生成橙黄色甲臜，吸光度值与活细胞数量正相关。
2、操作步骤
1、 细胞准备：
消化贴壁细胞或收集悬浮细胞，离心重悬后调整浓度，接种至 96 孔板（100μL / 孔）。
培养 24 小时至细胞贴壁。
2、加药处理：根据实验目的添加药物，孵育指定时间。
3、检测显色：
每孔加入 10μL CCK-8 溶液，37℃孵育 1-3 小时。
酶标仪测定 450nm 处吸光度。
3、注意事项
细胞状态：确保细胞密度均匀，避免过度生长或状态不佳。
操作细节：加样时枪头避免接触孔壁，防止 “跳孔” 误差。
试剂优势：富衡 CCK-8 经多次验证，灵敏度高，重复性好，客户复购率高。
WB（蛋白免疫印迹）实验全流程
1、实验目的与应用
用途：定性 / 定量分析蛋白质表达（如磷酸化蛋白、目标蛋白丰度）。
2. 关键步骤解析
| 阶段 | 操作要点 | 注意事项 |
| 蛋白提取 | 2. BCA 试剂盒测定蛋白浓度。 | - 磷酸化蛋白需添加磷酸酶抑制剂。 |
| 电泳与转膜 | 2. 转膜时标记膜正反，避免顺序混淆。 | - 膜左上角剪角标记上样顺序。 |
| 封闭与孵育 | 2. 一抗 4℃过夜，二抗室温孵育 1-2 小时。 | - 抗体浓度按说明书优化。 |
| 显影分析 |
3、常见问题与解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方法 |
| 条带模糊 / 缺失 | ||
| 背景高 | ||
| 蛋白降解 |
问题与解答
A: 加样不规范或枪头接触孔壁。可以从高浓度到低浓度加样，避免枪头贴壁，重复实验取平均值。
A: 细胞类型错误（如悬浮细胞误当贴壁细胞）、培养皿未做 TC 处理。先确认细胞类型，再使用 TC 处理培养皿，复苏后静置 2 天观察。
A: 定期对实验室使用消毒剂进行消杀，如 “细胞金盾” 系列（培养箱除菌剂、水盘抑菌剂）；使用支原体清除剂等污染清除剂进行预防；避免与他人细胞混放。
A: 细胞处理 2 天 + 蛋白提取 1 天 + 电泳转膜 1 天 + 孵育显影 2 天，总计约 5-7 天。
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