【知识库】为什么GPC需要光散射？

凝胶渗透色谱分离原理

凝胶渗透色谱(GPC)，又称尺寸排除色谱(SEC)，是一种使用特殊的色谱柱、按照尺寸大小分离天然与合成高分子、生物高分子的色谱技术。

GPC 色谱的操作原理是利用分子的流体力学半径(Rh)或流体力学体积(Vh)进行分离，而非利用分子量的差异。分离过程在GPC色谱柱中进行，其柱填充物通常是聚苯乙烯凝胶、玻璃粉或硅胶等多孔物质。由于分子大小的差异，较大的分子无法进入凝胶的空隙，能更快的从色谱柱中被洗脱。

凝胶渗透色谱过程始于单相色谱泵，它推动流动相持续流过系统管路。系统内置脱气机则会去除管路以及溶剂中气体，以提高信号稳定性，降低噪音。进样方式可以是人工进样或自动进样。样品溶液随即被导入GPC色谱柱，开始尺寸分离过程。当样品从色谱柱被洗脱后，它将被一个或多个检测器进行检测，其结果最终被电脑的数据处理系统进行分析。

GPC色谱的分析程度取决于系统检测器的种类与数量。通过选定不同的检测器，按照不同的校准方法可以计算出分子量(MW)、分子量分布(MWD)、特性粘度(IV)、分子密度、水力半径(Rh)与回转半径(Rg)等参数。同时，也可能获得诸如构造、聚集度、支化等大分子结构以及共聚物组成等额外信息。

根据检测系统(检测器的数量及类型)的不同，常见有以下两种实验方法：

传统校准法

三检测联用法(包含了光散射检测器)

其中，传统检测法运用浓度检测器和已校准的GPC柱，能够测量相对分子量和聚合度多分散性。而光散射检测器和浓度检测器联用，能够提供绝 对分子量、分子尺寸大小、特性粘度以及分子构成、聚集与支化的信息。

GPC原理

传统校准法

由于在凝胶渗透色谱原理中，分子是根据其流体力学体积实现分离，再使用一个或多个检测器进行对GPC柱的洗脱液进行检测。传统校准法通常使用示差折光检测器或紫外可见光谱仪进行检测，配以已校准的色谱柱，可供测定相对分子量、分子大小以及聚合物多分散性。

在传统校准法中，分子量(MW)与分子量分布(MWD)是根据以校准曲线对保留体积(RV)作图(log MW vs. RV)计算得到的，而校准曲线可通过对一系列已知分子量的标样进行测试获得。

传统校准法的操作步骤如下：

使用分子量已知的窄分布系列样品进样

测量信号峰的保留体积

建立校准曲线(Log(MW) 对保留体积)

注意：使用测得的保留体积代替时间是为了消除流速的影响，而且您选择的标样必须覆盖被测样品的全部分子量范围。

获得校准数据后，我们可以通过其曲线来描述保留体积与分子量之间的关系，通常使用多项式拟合来计算：

Log M= A0+A1V+A2V2+...+AnVn

在获得了标准曲线后，计算未知样品分子量就是一个简单的步骤。通常，高分子科学家对分子量分布的至少三种特性感兴趣。它们分别是重均分子量、数均分子量以及Z均分子量，其定义分别如下：

上图中，Mi是在i点的分子量，Ci是在i点的浓度(或质量分数)。

传统校准法的缺点是忽略被测样品与标准样品组分和结构的差异。请记住，GPC分离是基于流体力学体积，而非分子量。因此，在使用传统校准法测定分子量时，我们必须假设被测样品与标样的密度相同。然而在一般情况下，事实并非这样。所以我们通常把传统校准法的测量结果称为相对分子质量。

GPC原理

光散射检测器联用

传统校对法中应用的浓度检测器和光散射检测器联用，是最受青睐的表征天然与合成高分子与蛋白质的解决方案。它同时使用两种检测器，各个检测器功能各有所长且互为补充。

光散射检测器提供分子量的直接测量，无需校准色谱柱。仅需要使用单个窄分布标样，就能够完成所有检测器的校准，并对检测器间的结果偏移和谱带增宽效应进行修正。

此外，光散射检测器独特的优势在于它能够通过一次进样测试得到绝 对分子量、分子大小(可小于1nm)的信息。它也是唯 一能够在持续流动模式下在线采集并提供大量数据的检测技术，还能图形化地直观显示结果。

为测定分子量，所有光散射检测器都采用基于瑞利方程的原理，即散射光的强度等于一个可变常数、样品浓度、dn/dc平方、分子量三者的乘积。

根据瑞利方程，散射光的强度必须在零角度测量。这就要求您直视入射光，是不可能实现的。因此，必须对零角度的散射光强度进行估计，主要有两种方式：

小角度测量散射光强度(LALS)。当角度小于等于10度时，误差可忽略不计。

在多个角度测量散射光强度，并外推至零度角(MALS)。可通过以角度对散射光信号作图得到。

对于小于10nm的分子，由于不存在角度依赖性，两种方法都可以提供准确的分子量信息。随着分子量的增长，分子对来自不同角度的不同强度的光线，其散射存在一种规律，被称为角度依赖性。不过，对于大于10nm的分子，LALS是唯 一能够不需要外推或修正就能测定分析量的方法。LALS是最简洁且完全基于理论的测定分子量的方法。在其应用中，在能够进行测定的最小角度为7度，此时测得的散射光强度可以避免电子产生较大误差。

曾经，由于溶剂中颗粒产生的信号噪音使LALS的信噪变差，测定低分子量大分子困难较大。然而，通过提高溶剂纯度、使用滤膜、改进GPC/SEC柱技术以及升级LC泵，可有效地去除了样品中的颗粒。此外，OMNISEC软件能够运行降噪算法减少溶剂中可能存在的颗粒对测定结果的影响。

随着近年来检测技术本身的进步，基于Viscotek专利设计的LALS能够有效地消除小角度实验中的噪音，使光散射检测器可以被用于任何测定绝 对分子量的实验，而无需外推或修正。

为什么GPC需要光散射检测器?

为什么需要光散射检测器

检测概念不同

通过RI和光散射检测器连用，凝胶渗透色谱GPC/SEC在一个测试过程中同时收集RI和光散射信号，得到绝 对分子量Mw、Mn、Mz，分子量分布，旋转半径。而通过传统校正在一个测试过程中收集RI信号，得到相对分子量Mw、Mn、Mz，分子量分布。

为什么需要光散射检测器

标准样品影响

通过光散射检测器检测绝 对分子量只需要仪器常数KLS和KRI，而仪器常数只取决于流动相的种类检测温度，不取决于任何标准样品以及标准样品的种类。

LS = KLS• (dn/dc)2•M•C

RI = KRI•(dn/dc)•C

而对于传统校正而言，其计算结果严重依赖于标准样品的种类和来源!相对分子量的计算取决于校正曲线，所有影响校正曲线的因素将对于计算结果造成影响，而标准样品是影响校正曲线的重要因素之一。使用不同高分子标准样品由于分子密度的差异，得到不同的标准曲线。即使使用同一种标准样品，相同供应商的不同批次，校正曲线也会有所差异，导致分子量结果不同。

为什么需要光散射检测器

保留时间影响

通过光散射检测器检测绝 对分子量不依赖于样品信号保留时间!分子量结果和重复性只与RI和光散射信号强度相关，与保留时间无关，因而可以得到极高的准确性和重复性。

传统校正严重依赖于样品信号保留时间!由于色谱柱老化，色谱泵不稳定，测试温度波动造成的样品RI信号保留时间的改变会造成分子量结果的明显差异。

为什么需要光散射检测器

对分子量分布的检测准确性

高分子分布信息的准确性取决于分子量检测的准确性。对于窄分布样品如蛋白质，光散射得到的绝 对分子量能够正确地表征样品的分布信息。而传统校正由于其分子量是通过校正曲线得到，其分子量在不同的流出时间在校正曲线上有所差别，所以得到的分子量分布与样品的真实结果会有明显偏大。这将影响到检测者得到正确的结论。

为什么需要光散射检测器

判断测试质量

通过光散射和RI检测器的结合使用，还可以有效判断GPC的测试质量。在GPC检测过程中如果在错误的制备条件下检测样品，(意味着流动相、色谱柱种类错误)，都可能造成高分子样品在色谱柱上的吸附。而高分子在色谱柱上的吸附将会造成GPC在分离过程中高分子材料不按照从大到小的顺序流出，这将导致错误的分子量和分子量分布结果。

通过光散射检测器和RI检测结合，可以得知样品在色谱柱上有无吸附，判断依据如下：

绝 对分子量是否随着保留时间增加

光散射检测器是否有脱尾，且其回归基线时间是否晚于RI回归基线时间

如果同时出现以上两种情况，则说明样品在色谱柱上有吸附，需要重新设定检测条件。

传统校正的相对分子量由校正曲线得到，永远随保留时间下降，检测者无法得到样品检测条件是否正确的任何信息!

为什么需要光散射检测器

检测聚集体

光散射检测器信号对于大分子物质极其敏感，即使是微量存在的大颗粒或者团聚物，也可以得到较强信号。这对于生物领域尤其是蛋白质的研究工作者具有非常重要的意义。而RI检测器只对应于样品的浓度，对于微量存在的团聚物无法检测。

为什么需要光散射检测器

检测效率高

通过光散射检测器检测绝 对分子量只需要得到仪器常数，无需色谱柱校准。在不更换溶剂的条件下，通常不需要测试标准样品。更换溶剂时需要得到新的仪器常数。而对于传统校正而言，需要经常检测标准样品已确定色谱柱、色谱泵、工作曲线是否正常。而每次标准曲线的测定则需要使用7-13个标准样品，极大地增加了使用者测定样品所需时间。

综上所述，总结GPC搭配光散射多检测器和单RI检测器的区别如下：

光散射检测器

单 RI 检测器

分子量检测方法

瑞利散射方程直接检测，无需色谱柱校准

校正色谱柱，通过校正曲线，按照样品流出时间计算

检测结果

绝 对分子量及其分布，分子大小Rg

相对分子量及其分布

对标准样品种类、来源依赖性

几乎不依赖

严重依赖

对于样品测试质量判断

提供有力证据

无法给出判断

检测效率

高

需要繁琐的标准曲线测定

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