聚焦外泌体，超离方案大放送！

外泌体在近年来获得了医药行业更多的关注，而超速离心法又是分离外泌体最常用的方法之一。今天，小 E 汇编了不同样本来源的外泌体离心纯化方案，帮助大家更深入地了解这一热门研究领域。

外泌体有着重要的研究价值

胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是由细胞释放的具有膜结构的脂质封闭球体，包括外泌体，微囊泡和凋亡小体等不同亚群[1]。EVs 首次于 1983 年在哺乳动物细胞中观察到，并被认为在去除红血球中的膜和蛋白质废物中有功能[2]。

▲ EVs分类：a)外泌体；b)微囊泡；c)凋亡小体[3]

到 20 世纪 90 年代末，人们对 EVs 的兴趣迅速增长，发现它们可以作为治 疗和诊断标志物。到 2007 年， Valadi Hadi 发现 EVs 携带 mRNA 和 miRNA，可以作为细胞间遗传信息交换的媒介[4]。目前，人们认为 EVs 是细胞间蛋白质和 RNA 交换的重要途径[5]。越来越多的研究发现，EVs 在细胞交流、受精、免疫反应、疾病过程、肿瘤转移、细胞生长和组织修复中发挥重要作用。

在上文提到的三种 EVs 中，外泌体的平均粒径最小、均一度相对最 高、功能最为多样，理论和应用价值也最 高，因此得到了最深入的研究和应用。值得一提的是，外泌体的来源十分广泛，几乎可由所有种类的细胞分泌，并存在于人体各种体液之中：如血液、尿液、 唾液、乳汁、脑脊液等等……

▲ 外泌体来源广泛[6]

以下是 4 个不同来源外泌体的分离方案，让我们一起看看高分文章是如何做外泌体分离的。

1

血液来源【首都医科大学】

研究表明，外泌体的 lncRNA 与神经退行性疾病发展相关联。文本采用静脉穿刺抽取帕金森病患者的外周血液样本，去除细胞碎片和大颗粒杂质后，作者使用了 CP100NX 超速离心机搭配 P50AT2 固定角转，4℃, 100,000 xg 离心 2h，随后重复离心一次，获得了纯化的外泌体，后续用于与帕金森发病相关的外泌体 lncRNA 的研究。

2

植物来源【武汉大学】

植物细胞外囊泡(EVs)在分子从宿主到相互作用的微生物的跨界运输中起着关键作用，尤其是在植物的防御反应中。这篇论文比较了现有的拟南芥 EVs 分离方法，并提出了详细的植物 EV 分离和纯化方法指南。

▲ 植物 EVs 的分离和小分子 RNA 的检测；（A）植物质外体液分离标准方法；（B）利用差速离心法从质外体液中沉降植物 EVs；（C-D）核酸酶和蛋白酶处理 EVs 检测内含小分子 RNA。

结论之一是：100,000 xg 能更高效分离植物 EVs，尤其是对直径较小的囊泡，比如 TET8 标记的外泌体等有更高的分离效率。作者采用了不连续密度梯度超速离心法（碘克沙醇），搭配 CP80NX 超速离心机和 P40ST 水平转子（13PA 薄壁管），4℃，100,000 ×g，离心 17h 即可高效分离 EVs。

3

干细胞来源【重庆医科大学】

本文研究了脂肪源性干细胞外泌体(ADSC-Exos)是否在创伤性骨缺损中发挥免疫调节作用。作者在无血清培养基中培养 ADSCs 48 小时后，依次低速离心去除了细胞碎片等杂质，随后使用 CP100NX 超速离心机搭配固定角转，100,000 xg 离心 70min，重复离心一次，收获了纯化的外泌体颗粒。

4

外周血单核细胞来源

【第二军医大学附属长海医院】

本文开发了一种方法来分离与整合素 αvβ3 结合增强型的外泌体。作者通过在无血清培养基中培养 THP-1（人单核细胞白血病细胞），通过低速离心和膜过滤去除细胞碎片和微囊泡。随后使用 CP80NX 超速离心机搭配 P70AT 固定角转，4℃， 100,000 ×g 离心 70min 获得粗提外泌体，随后将沉淀重悬，转移至小体积的 P50A3（24x1.5mL）固定角转，4 °C，100,000 ×g 再次离心 70min，从而获得了纯化的外泌体组分。