血清蛋白的琼脂糖凝胶电泳

　　本实验介绍了血清蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤等。

　　实验原理：

　　琼脂糖（agarose）是经过挑选，以质地较纯的琼脂（agar）作为原料而制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一含有硫酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质会给电泳及凝胶过滤以不良的影响。琼脂糖是直链多糖，它由D－半乳糖和3,6－脱水－L－半乳糖的残基交替排列组成。

　　琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（98－99%），近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的电泳材料，分离效果较好。

　　血清中脂类物质与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小也相差很大，因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。

　　琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中，通电后可以看到脂蛋白向正极移动，并分离出几个区带。正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从阴极到阳极依次为β－脂蛋白（Z深），前β－脂蛋白（Z浅）及α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些），在原点处应无乳糜微粒。有时前β－脂蛋白也显示不出来。

　　琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（98－99%），近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的电泳材料，分离效果较好。

　　血清中脂类物质与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小也相差很大，因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。

　　琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中，通电后可以看到脂蛋白向正极移动，并分离出几个区带。

　　正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从阴极到阳极依次为β－脂蛋白（Z深），前β－脂蛋白（Z浅）及α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些），在原点处应无乳糜微粒。有时前β－脂蛋白也显示不出来。

　　主要试剂：

　　1. 苏丹黑染色液　　

　　将苏丹黑B加到无水乙醇中至饱和，摇荡使乙酰化。用前过滤。

　　2. 缓冲液　　

　　称取钠15.4g、2.76g及EDTA0.29g，加水溶解后再加蒸馏水至1000mL（pH为8.6，离子强度0.075），为电极缓冲液。

　　3. 凝胶缓冲液　　

　　取三羟甲基氨基甲烷1.212g、EDTA0.29g及NaCl5.85g，用蒸馏水溶解后，稀释至1000mL，pH为8.6。

　　4. 琼脂糖凝胶　　

　　称取琼脂糖0.45 g溶于50 mL凝胶缓冲液中，再加水50 mL。在水浴中加热至沸，待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。

　　主要设备:：

　　1. 37℃水浴锅

　　2. 高速离心机

　　3. 吸管

　　4. 载玻片

　　5. 低温冰箱

　　6. 毛细管

　　7. 电泳设备

　　8. 80℃烘箱

　　实验材料:血清

　　实验步骤:

　　1. 预染血清　　

　　血清0.2mL中加苏丹黑染色液0.2mL，混合置37℃水浴中染色30分钟，离心（2000转/分）约5分钟。以除去悬浮于血清中染料沉渣。

　　2. 制备琼脂糖凝胶板　　

　　将已配制好的0.5%琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化，用吸管吸取凝胶溶液浇注在载玻片上，约3 mL。静置半小时后凝固（天热时需延长，也可放入冰箱中数分钟以加速凝固）。

　　3. 点样　　

　　将剪好的滤纸条对折，以折边在距凝胶一端2cm处切一点样口。将毛细管插入预染好的血清中，待吸入部分血清后，取毛细管使其有样品的一端靠于点样口端部，停靠3秒左右。

　　4. 电泳　　

　　将凝胶板平放入电泳槽中，使加样端接在阴极一侧，用四层滤纸或纱布做成“引桥”，敷于胶板的两端，各搭住凝胶板约1cm左右，“引桥”的另一端浸于电泳槽内的缓冲液中。接通电源，首先调节电流为3-4mA/凝胶板，电泳10－15分钟；然后调节电流为6-7mA/凝胶板，电泳30－40分钟，即可观察到分离的区带。

　　5. 如果需要保留电泳图谱，可将电泳后的凝胶板（连同载玻片）放入清水中浸泡脱盐2小时，然后放烘箱（80℃左右）中烘干即可。

　　注意事项：

　　1. 电泳样品应为新鲜的空腹血清。

　　2. 加热溶化琼脂时，须防止水份蒸发过多。琼脂糖凝胶**随用随制，以免凝胶表面干燥，影响分离效果。

　　3. 制作凝胶板时琼脂糖浓度一般选用0.5%左右为宜，高于1%以上α－脂蛋白部分较紧密，β和前β－脂蛋白部分不够清晰；低于4.5%则凝固性较差，图谱不清。

　　4. 点样口要大小适宜，边缘整齐、光滑，否则会影响电泳图谱。

　　5. 在α－脂蛋白前若出现较浅区带，可列为前α－脂蛋白。

　　6. 正常参考范围

　　α－脂蛋白20~30%

　　β－脂蛋白 20~30%

　　前β－脂蛋白 0~28%

　　乳糜微粒（-）

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