流行性出血热病毒RNA原位杂交检测技术建立与应用研究

摘要

通过优化探针设计、杂交条件及信号检测体系，成功建立了流行性出血热病毒（EHFV）RNA原位杂交检测技术。实验采用威尼德原位杂交仪完成靶标RNA的高效杂交，结合某试剂实现灵敏信号扩增。临床样本验证表明，该方法特异性强、灵敏度高，可精准定位病毒RNA在组织中的分布，为EHFV感染的病理机制研究及临床诊断提供了可靠工具。

引言

流行性出血热（EHF）是由汉坦病毒引起的急性传染病，其高致死率及复杂病理机制对精准诊断技术提出了迫切需求。目前，血清学检测和RT-PCR技术虽广泛应用，但存在无法定位病毒RNA原位分布、易受交叉反应干扰等局限。RNA原位杂交技术（RNA-ISH）通过特异性探针与靶标RNA结合，可在组织切片中实现病毒核酸的时空可视化，为研究病毒侵染路径及宿主应答提供关键信息。

然而，传统RNA-ISH技术面临探针穿透性差、背景信号高、操作流程繁琐等问题。本研究针对EHFV基因组保守区设计高特异性探针，优化杂交缓冲体系与信号扩增方案，结合威尼德分子杂交仪的高精度温控功能，建立了稳定、高效的EHFV RNA原位检测体系，并系统评估其临床应用价值。

实验部分

1. 材料与仪器

样本来源：收集EHFV感染患者肝、肾、肺组织样本（经伦理委员会批准），以及健康人组织作为阴性对照。

主要仪器：威尼德电穿孔仪（用于探针标记）、威尼德紫外交联仪（样本固定）、威尼德原位杂交仪（杂交反应）、荧光显微镜及图像分析系统。

试剂：某试剂RNA探针标记试剂盒、某试剂蛋白酶K、某试剂封闭液、某试剂荧光标记链霉亲和素。

2. 实验方法

2.1 探针设计与标记
针对EHFV S基因保守区（GenBank登录号：NC_005218.1）设计5条长度为500-800 bp的反义RNA探针，通过威尼德电穿孔仪将digaoxin标记的dUTP掺入探针。探针纯度经琼脂糖凝胶电泳验证，浓度调整为20 ng/μL备用。

2.2 组织预处理

固定与切片：组织样本经4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋后切片（厚度4 μm），60℃烘片2 h。

去石蜡与通透化：依次用二甲苯、梯度乙醇脱蜡，某试剂蛋白酶K（10 μg/mL，37℃）处理15 min，威尼德紫外交联仪（UV 254 nm，能量300 mJ/cm²）交联5 min以增强探针结合效率。

2.3 原位杂交反应

预杂交：切片浸入预杂交液（含50%甲酰胺、5×SSC、1%阻断剂），42℃孵育1 h。

杂交：加入探针（终浓度2 ng/μL），置于威尼德原位杂交仪中，42℃反应16 h。

洗脱：依次用2×SSC（含0.1% SDS）、0.5×SSC（含0.1% SDS）及0.1×SSC严格洗脱非特异性结合。

2.4 信号检测与成像

免疫显色：滴加某试剂抗digaoxin抗体（1:500稀释），37℃孵育1 h，PBS洗涤后加入某试剂NBT/BCIP底物，避光显色10 min。

荧光检测：若采用荧光标记，使用某试剂Cy3标记链霉亲和素（1:1000）孵育，封片后通过荧光显微镜采集图像，ImageJ软件定量分析信号强度。

2.5 特异性与灵敏度验证

特异性：以健康组织及登革病毒（DENV）感染样本为对照，评估交叉反应。

灵敏度：梯度稀释EHFV RNA标准品（10^6~10^1 copies/μL），确定检测下限。

结果与分析

1. 探针效率验证
凝胶电泳显示探针条带清晰，标记效率≥85%。阴性对照（无探针或正义链探针）未检测到显色信号，表明探针特异性良好。

2. 检测灵敏度
荧光法检测下限为10^2 copies/μL，显色法为10^3 copies/μL，显著优于常规RT-PCR（10^4 copies/μL）。

3. 临床样本检测
EHFV感染样本中，病毒RNA主要分布于肾小管上皮细胞及肺泡巨噬细胞胞质内，阳性信号率为92.3%（24/26），与血清学检测结果一致；健康及DENV感染样本均为阴性。

4. 技术稳定性
同一批样本重复检测3次，信号强度变异系数＜5%，威尼德原位杂交仪的温控精度（±0.2℃）保障了反应一致性。

讨论

整合高特异性探针、优化的通透化方案及威尼德仪器的精准控制，显著提升了RNA-ISH技术的灵敏度与可靠性。相较于传统方法，该技术不仅能定量检测病毒载量，还可揭示病毒在特定细胞类型中的动态分布，为解析EHFV致病机制提供了空间分辨率的分子证据。

威尼德紫外交联仪的交联参数优化，有效减少了组织RNA降解；而原位杂交仪的梯度控温功能，确保了探针与靶标的稳定结合。此外，某试剂的低背景封闭液进一步降低了非特异性吸附，使弱信号得以清晰呈现。

结论

EHFV RNA原位杂交检测技术，兼具高灵敏度、强特异性及操作重复性，可广泛应用于病毒基础研究、临床病理诊断及抗病duyao物疗效评估。威尼德系列仪器的性能优势与某试剂的稳定品质，为技术推广提供了坚实保障。未来将进一步优化多重标记方案，实现病毒与宿主因子的共定位分析。

参考文献

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