鸡胰蛋白酶（Trypsin）ELISA检测试剂盒使用说明书

鸡胰蛋白酶（Trypsin）ELISA检测试剂盒使用说明书

BS-4401  鸡胰蛋白酶(trypsin)ELISA试剂盒

本试剂盒仅供研究使用，不用于临床诊断。

一、 简介与原理

1. 简介：
鸡胰蛋白酶（Trypsin）是一种丝氨酸蛋白酶，在禽类消化和生理过程中起着关键作用。本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（Sandwich ELISA）定量检测鸡血清、血浆、细胞培养上清液或其他生物液体样本中的胰蛋白酶浓度。

2. 实验原理：
本实验采用双抗体夹心法。

• 将特异性抗鸡Trypsin抗体预包被在微孔板上。

• 加入样本和标准品，其中的Trypsin会与孔板上的捕获抗体结合。

• 洗板后，加入生物素标记的检测抗体，与Trypsin的另一位点结合，形成“抗体-抗原-抗体”复合物。

• 再次洗板后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（Streptavidin），后者会与生物素特异性结合。

• 加入底物TMB显色液，在HRP的催化下产生蓝色产物，加入终止液后变为黄色。

• 用酶标仪在450 nm波长下测量各孔的吸光度（OD值），其颜色深浅与样本中的Trypsin浓度成正比。通过绘制标准曲线，即可计算出样本中Trypsin的实际浓度。

二、 试剂盒组成

（注：请于收到试剂盒后核对各组分数量，并参照标签说明进行保存。）

三、 自备材料与设备

• 酶标仪（450 nm滤光片）

• 精密移液器及一次性吸头

• 涡旋混合器

• 37℃恒温孵育箱

• 洗板机或手动洗板设备（多道移液器）

• 蒸馏水或去离子水

• 用于稀释标准品和样本的试管、EP管

• 吸水纸

四、 实验前准备

1. 平衡室温：将所有试剂（除标准品外）取出，平衡至室温（18-25℃）约30分钟后再使用。

2. 配制洗涤液：将浓缩洗涤液（20X） 用蒸馏水或去离子水按 1:19 稀释，即1份浓缩洗涤液加19份水，混匀后即为工作浓度洗涤液。

3. 配制标准品：

• 若标准品为冻干粉：加入指定体积的样本稀释液进行复溶，静置片刻，轻轻涡旋混匀。此溶液为浓度标准品（Stock）。

• 若标准品为液体：直接进行系列稀释。

• 按照说明书要求，用样本稀释液进行倍比稀释，制备一系列不同浓度的标准品点（例如：1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 pg/mL）。通常设置7个标准品点和一个零点（样本稀释液作为空白孔）。

4. 稀释样本：根据预实验或文献报道，用样本稀释液对未知样本进行适当稀释（如10倍、100倍稀释）。建议初次实验设置多个稀释度，以确保OD值落在标准曲线线性范围内。

五、 操作步骤

总流程概要： 加样 → 孵育 → 洗板 → 加检测抗体 → 孵育 → 洗板 → 加酶结合物 → 孵育 → 洗板 → 显色 → 终止 → 检测

1. 加样：

• 设置标准品孔、样本孔和空白孔（Blank）。

• 标准品孔：加入不同浓度的标准品100 μL。

• 样本孔：加入已稀释的待测样本100 μL。

• 空白孔：加入样本稀释液100 μL。

• 注意：每个标准和样本建议设2-3个复孔。

• 盖上封板膜，在37℃下孵育90分钟。

2. 洗板：

• 小心揭掉封板膜，弃去孔内液体。

• 每孔加满工作洗涤液（约350 μL），静置30秒后弃去，如此重复洗板3次。

• 一次洗板后，在吸水纸上拍干，确保无液体残留。

3. 加检测抗体：

• 除空白孔外，每孔加入生物素标记的检测抗体100 μL。

• 盖上新的封板膜，在37℃下孵育60分钟。

4. 洗板：

• 重复步骤2的洗板过程，共洗板3次。

5. 加酶结合物：

• 每孔（包括空白孔）加入HRP标记的链霉亲和素100 μL。

• 盖上新的封板膜，在37℃下孵育30分钟（避免光照）。

6. 洗板：

• 重复步骤2的洗板过程，共洗板5次（此步需更净，减少非特异性结合）。

7. 显色：

• 每孔（包括空白孔）加入TMB底物溶液90 μL。

• 盖上封板膜，在37℃避光条件下显色15-20分钟。期间密切观察标准品孔的颜色变化（出现梯度蓝色）。

8. 终止：

• 当最高浓度标准品孔呈现明显的蓝色，且梯度良好时，每孔加入终止液50 μL。溶液颜色立即由蓝变黄。

9. 检测：

• 在加入终止液后15分钟内，用酶标仪在450 nm波长下测量各孔的吸光度（OD值）。

• 设置：先用空白孔调零。

六、 结果计算

1. 计算每个标准品和样本复孔的平均OD值。

2. 以标准品的浓度为横坐标（X轴），对应的平均OD值为纵坐标（Y轴），在半对数坐标纸上或用软件（如Excel，选择四参数 logistic (4-PL) 曲线拟合）绘制标准曲线。

3. 将样本的平均OD值代入标准曲线方程，计算出对应的浓度（X值）。

4. 重要：计算出的样本浓度必须再乘以样本的稀释倍数，才能得到样本中Trypsin的实际浓度。

七、 注意事项

• 安全：终止液为稀liusuan，具有腐蚀性，请佩戴手套和护目镜操作。如不慎接触皮肤，立即用大量清水冲洗。

• 试剂保存：未使用的板条应立即放回带有干燥剂的铝箔袋中密封，2-8℃保存。TMB和酶结合物对光敏感，需避光保存。

• 操作规范：精确的移液和的洗板是实验成功的关键。避免交叉污染。

• 时效性：所有试剂应在有效期内使用。复溶后的标准品分装冻存于-20℃，避免反复冻融。

• 线性范围：如果样本OD值超出标准曲线最高点，请增加稀释倍数后重新检测。

• 质量控制：建议每次实验都运行标准曲线，并设置质控样本。

• 注：以上资料仅供参考，不作为实际数据，如需其他请咨询技术老师或品牌供应商。

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