蜂产品中双甲脒及其代谢物残留量的测定
参考GB 31657.8-2025 《食品安全国家标准 蜂产品中双甲脒及其代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》
双甲脒是一种常用于畜牧业和农业的广谱杀虫剂，通过干扰虫类神经递质的代谢达到防治病虫的效果，蜂产品中使用可以达到防治蜂螨的效果。双甲脒化学性质不稳定，在生物体内易代谢成具有致癌性的2,4-二甲基苯胺，对人体健康造成威胁。GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定牛、羊、猪及蜂蜜中的限量为0.4mg/kg, 并将双甲脒及其代谢产物 2,4-二甲基苯胺的总和作为残留标志物。
GB 31657.8-2025 《食品安全国家标准 蜂产品中双甲脒及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》是由中华人民共和国农业农村部、国家卫生健康委员会和国家市场监督管理总局三大部委联合发布的重要技术标准。该标准已于2025年6月3日发布，并定于2025年9月1日起正式实施。本方法使用液相色谱串联质谱进行测定，具有更高的灵敏度和更低的检出限。
迪马科技参考GB 31657.8-2025重现了此方法，使用磷酸二氢钾缓冲液溶解样品，乙腈提取，使用我司色谱柱Leapsil C18，100x4.6mm，2.7μm (Cat.#: 86002)进行测定，基质匹配标准溶液进行计算，添加水平为5μg/kg的蜂蜜样品加标回收率可做到双甲脒51%-63%，2,4-二甲基苯胺80%-86%；添加水平为10μg/kg的蜂王浆样品加标回收率可做到双甲脒60%-72%，2,4-二甲基苯胺65%-73%。
经过大量实验测试，原方法重现性较差，且回收率偏低。我司对缓冲盐的使用进行了优化，使用弱碱性的磷酸氢二钾缓冲液代替磷酸二氢钾后，减弱了前处理过程中双甲脒的代谢速率，降低了由于大量代谢中间产物反应不彻底造成的回收率损失，有利于实验结果的重现，更容易达到标准中批内样品相对标准偏差≤20%的要求。使用0.2mol/L磷酸氢二钾作为缓冲液后，回收率普遍提升了30%左右，大大降低了假阴性风险，增加了定量分析的准确性。
由于原方法做蜂王浆样品有强基质效应，我司增加了净化步骤，经过大量实验，使用我司ProElut PMR 150mg/3mL(Cat.#: 65996)对样品提取液净化后，对目标物不产生吸附的同时，蜂王浆样品可由强基质效应降低为中等基质效应，减少了样品对离子源的污染并增加了仪器使用寿命，该净化方法简单、快捷，客户可根据实际需求选择使用。
本方案适用蜂蜜和蜂王浆双甲脒和2,4-二甲基苯胺的测定。
(1) 双甲脒和2,4-二甲基苯胺混合标准储备液：由迪马科技标准品部提供(Cat.#: 48872)，浓度为100μg/mL溶于乙腈。
(2) 双甲脒和2,4-二甲基苯胺混合标准中间液Ⅰ：准确吸取适量双甲脒和2,4-二甲基苯胺混合标准储备液，用50%乙腈水配制成标准中间液Ⅰ，浓度为5.0μg/mL。
(3) 双甲脒和2,4-二甲基苯胺混合标准中间液Ⅱ：准确吸取适量双甲脒和2,4-二甲基苯胺混合标准中间液Ⅰ，用50%乙腈水配制成标准中间液Ⅱ，浓度为125ng/mL。
(4) 双甲脒和2,4-二甲基苯胺混合标准中间液Ⅲ：准确吸取适量双甲脒和2,4-二甲基苯胺混合标准储备液，用50%乙腈水配制成标准中间液Ⅲ，浓度为1.0μg/mL。
(5) 双甲脒和2,4-二甲基苯胺混合标准中间液Ⅳ：准确吸取适量双甲脒和2,4-二甲基苯胺混合标准中间液Ⅲ，用50%乙腈水配制成标准中间液Ⅳ，浓度为25ng/mL。
蜂蜜：
(1) 称取5g样品于50mL塑料离心管中；
(2) 向离心管中加入5mL 0.2mol/L磷酸氢二钾溶液；
(3) 向离心管中加入5mL乙腈，振荡5min；
(4) 向离心管中加入5g氯化钠和5g无水硫酸镁，立即摇匀，振荡5min；
(5) 冷水浴5min；
(6) 8000rmp离心5min；
(7) 移取上清液至另一个离心管中待净化。
蜂王浆：
(1) 称取2g样品于50mL塑料离心管中；
(2) 向离心管中加入2mL 0.2mol/L磷酸氢二钾溶液；
(3) 向离心管中加入10mL乙腈，振荡5min；
(4) 向离心管中加入3g氯化钠和3g无水硫酸镁，立即摇匀，振荡5min；
(5) 冷水浴5min；
(6) 8000rmp离心5min；
(7) 移取上清液至另一个离心管中待净化。
ProElut PMR 150mg/3mL (Cat.#: 65996)
样品：准确吸取2mL待净化液于PMR小柱，接收流出液，吸取流出液0.5mL于2mL玻璃进样瓶(Cat.#: 1033)，加入0.5mL水，混匀，经0.22μm PTFE滤膜过滤(Cat.#: 37178)，待测定。
基质匹配混合标准工作液： 准确吸取2mL空白样品待净化液于PMR小柱，接收流出液，吸取流出液0.5mL于2mL玻璃进样瓶(Cat.#: 1033)，加入适量标准中间液，用水定容至1mL，混匀，经0.22μm PTFE滤膜过滤(Cat.#: 37178)，待测定。
UPLC条件
色谱柱：Leapsil C18，100 x 4.6mm，2.7μm (Cat.#: 86002)
流速：0.3mL/min
进样量：10μL
柱温：35℃
流动相：A:0.1%甲酸水溶液 B:甲醇
质谱条件
电离模式: ESI
扫描方式: 正离子扫描
检测方式: 多反应监测
电喷雾电压: 4500V
雾化气压力: 50psi
辅助气压力: 50psi
气帘气压力: 20psi
离子源温度: 500℃
1. 液相条件为反向条件下，2,4-二甲基苯胺在普通C18色谱柱上保留很弱，在50%乙腈水的溶剂条件下，洗脱能力太强，容易有溶剂效应，经过测试，使用我司色谱柱Leapsil C18，100 x 4.6mm，2.7μm (Cat.#: 86002)进行实验，对目标物有较好的保留，并且能消除溶剂效应。
2. 蜂王浆样品除了比蜂蜜样品有更强的基质影响，在进样过程中，还有更快的代谢速率。代谢速率测定实验结果显示，蜂王浆在等待进样过程中，每过1小时，就会产生2%的代谢物，蜂蜜产生0.5%的代谢物，建议自动进样器设置低温，降低双甲脒代谢速率。
3. 本方法在原方法基础上进行了优化，使用磷酸氢二钾替换了磷酸二氢钾，降低了代谢中间产物的不稳定性，提升了回收率，加标回收结果的重现性更好。
4. ProElut PMR净化小柱对样品中的脂类有很强的选择性吸附，同时不吸附目标物。两种添加水平的蜂王浆样品的基质效应从24.8%、16.4%分别提升到55.6%、40.4%，除了降低基质效应的效果非常明显，上样后，小柱上也残留有色杂质，见下图：
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