凯氏定氮仪测定灭活大肠杆菌粉疫苗中的蛋白质含量

1 前言

致病性大肠杆菌是人和多种动物（猪、鸡等）的致病菌之一。疫苗免疫是控制大肠杆菌病的主要方法。从动物体分离或实验室保存鉴定的大肠杆菌菌株，经扩增培养，配制成适当浓度，用甲醛灭活，使大肠杆菌失去毒力但又保持免疫原性，制成灭活疫苗。在疫苗中添加白油佐剂，有利于增强疫苗的免疫效果。本实验参照《ZG药典 2020 年版 第四部 0731 蛋白质含量测定 DY法 凯氏定氮法》对大肠杆菌粉疫苗中的蛋白质含量进行测定。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

K1160 全自动凯氏定氮仪，分析天平 。

2.2 试剂

20g/L 硼酸溶液，溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，400g/L 氢氧化钠，0.02mol/L 硫酸或盐酸标准滴定液。

3 实验方法

3.1 样品制备

非蛋白氮供试品溶液的制备：精密量取供试品适量（2020 版药典中规定如供试品为冻干制剂或固体粉末时，应复溶后量取，且蛋白质含量不高于 0.2g。由于本样品复溶困难，即称取 0.3~0.4g 样品。），置 20mL 容量瓶中，加水 10mL，10%钨酸钠溶液 2mL，0.33moL/L 硫酸溶液 2mL，加水至刻度，摇匀，静置 30 分钟，过滤，弃去初滤液（约 3~5mL），取续滤液作为非蛋白氮供试溶液。

3.2 取样

总氮供试品称取 0.05g（2020 版药典中规定如供试品为冻干制剂或固体粉末时，应用 0.9%氯化钠溶液定量稀释成每 1mL 中含氮量约 1mg 的溶液，然后量取 1mL 进行测定。由于本样品复溶困难，即称取 0.05g 样品。），非蛋白氮供试品量取 2mL 非蛋白氮溶液加入消化管中，各加入 3g 硫酸钾与 0.2 硫酸铜水，再沿瓶壁滴加硫酸 10ml。

3.3 消解

设定消解参数

表 1 消解参数设置

3.4 测试

定氮仪参数设置如下表。

表 2 定氮仪参数设置

4 结果与讨论

4.1 实验结果

表 3 大肠杆菌粉疫苗中的蛋白质含量测试结果

4.2 结论

测试结果显示本次测试的大肠杆菌粉疫苗中的蛋白质含量为 66.194%。 

参考文献

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[ M ] . 四部. 北京: ZG医药科技出版社, 2020: 附录 0731 蛋白质含量测定 DY法凯氏定氮法

注意事项

1）该样品为粉末样品，因此依据药典在样品制备时应制备成合适浓度的溶液进行测试，如样品复溶困难可直接称取相应重量样品进行测试。

2）本实验中蛋白质含量=（总氮含量-非蛋白氮含量）*6.25。