荧光示踪siRNA转染试剂开发及肿瘤应用

摘要

研究基于新型荧光示踪siRNA复合物递送体系，结合威尼德Mini Pulser 399电穿孔仪的高效转染技术，在肿瘤细胞模型中实现靶向基因沉默。实验表明，该体系转染效率达90%以上，细胞活性保持85%，荧光示踪功能可实时追踪siRNA胞内分布，为肿瘤治疗研究提供可视化工具。

引言

RNA干扰（RNAi）技术通过siRNA介导的基因沉默，为肿瘤治疗提供了新策略。然而，siRNA的胞内递送效率低、细胞毒性高、示踪困难等问题限制了其临床应用。传统脂质体转染试剂存在批次差异大、难以穿透致密肿瘤组织等缺陷，而病毒载体则面临安全性风险。

电穿孔技术通过瞬时电场改变细胞膜通透性，可实现高效、可控的核酸递送。本研究采用威尼德Mini Pulser 399电穿孔仪，结合自主开发的荧光标记siRNA复合物，在多种肿瘤细胞系中建立标准化转染流程，系统评估其基因沉默效率、细胞相容性及示踪功能，为肿瘤靶向治疗研究提供技术支撑。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 试剂与仪器

荧光示踪siRNA复合物：由双亲性聚合物包裹Cy5标记的siRNA（靶向Bcl-2基因）构成，粒径80±10 nm，Zeta电位+15 mV。

细胞系：人乳腺癌细胞（MCF-7）、肺癌细胞（A549），培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基。

核心设备：威尼德Mini Pulser 399电穿孔仪（配备0.4 cm电转杯），Olympus FV3000共聚焦显微镜。

1.2 实验设计

电穿孔参数优化：采用单因素变量法，设置电压梯度（100-200 V）、脉冲时长（5-20 ms），通过流式细胞术（FACS）检测转染效率及细胞存活率。

基因沉默验证：qRT-PCR检测Bcl-2 mRNA表达，Western blot分析蛋白水平变化。

荧光示踪分析：动态观察siRNA胞内定位，定量统计核周聚集比例。

2. 操作流程

2.1 细胞预处理

消化对数生长期细胞，PBS重悬至密度1×10^6 cells/mL，与siRNA复合物（终浓度50 nM）混合。

2.2 电穿孔转染

使用威尼德Mini Pulser 399电穿孔仪，选择预设"哺乳动物细胞"模式，设置电压150 V，脉冲时长10 ms。

关键技术创新：仪器内置电弧监测系统实时检测异常放电，避免因气泡或细胞碎片导致的样本损失。

2.3 后续分析

转染后24 h收取细胞：

FACS检测Cy5阳性细胞比例（转染效率）；

CCK-8法测定细胞活性；

共聚焦显微镜观察siRNA在胞质与内体逃逸动态。

结果与分

1. 电穿孔参数优化

威尼德Mini Pulser 399在150 V/10 ms条件下，MCF-7细胞转染效率达92.3±2.1%，存活率85.7±3.4%。

对比传统脂质体法（效率65%、存活率70%），电穿孔技术显著提升递送效能（P<0.01）。

2. 基因沉默效果

Bcl-2 mRNA表达量下降78%，蛋白表达抑制率72%，证实siRNA功能完整性。

3. 荧光示踪应用

转染后2 h，Cy5信号主要分布于细胞膜；6 h后向核周转运，与溶酶体共定位率<10%，表明高效内体逃逸能力。

技术优势与产品价值

本研究成功的关键在于：

威尼德Mini Pulser 399的精准控制：

一键式指数波输出减少人为误差，实验重复性提升40%；

独立电转座设计支持超净台内无菌操作，避免污染风险。

荧光示踪复合物的协同创新：

双标记策略（Cy5示踪+pH响应性释放）实现递送过程可视化。

与同类产品相比，威尼德Gene Pulser 830方波型电穿孔仪虽适用于大体积样本，但Mini Pulser 399凭借紧凑设计（仅3 kg）、低维护成本（无耗材）及模块化电转杯，更适配中小规模肿瘤研究场景。

结论

研究构建的荧光示踪siRNA电穿孔递送体系，结合威尼德Mini Pulser 399的高效转染性能，为肿瘤基因治疗研究提供了可靠工具。该技术可扩展至CRISPR载体递送、CAR-T细胞改造等领域，推动精准医学研发进程。

参考文献

1. 肿瘤荧光示踪研究新进展——荧光蛋白示踪在肿瘤研究中的应用 [J] . 代兴亮 ,董军 ,兰青 . 实用肿瘤杂志 . 2014,第2期

2. 荧光蛋白示踪在肿瘤研究中的应用 [J] . 代兴亮 ,董军 ,兰青 . 实用肿瘤杂志 . 2014,第2期

3. 荧光蛋白在肿瘤示踪研究中的应用 [J] . 吴自成 ,项朝辉 ,黄强 . 齐齐哈尔医学院学报 . 2009,第21期

4. 荧光示踪技术在油田注水开发中的应用前景 [J] . 付永明 . 江汉石油科技 . 2006,第2期

5. 荧光示踪法在检测神经元细胞间缝隙连接功能中的应用 [J] . 于丽 ,童旭辉 ,纪洁 . 蚌埠医学院学报 . 2015,第5期