科研前线丨氧电极丨氨氧化古菌产生氧化亚氮的酶学机制

科研前线丨氧电极丨氨氧化古菌产生氧化亚氮的酶学机制

氨氧化古菌（AOA）作为硝化细菌的一类，是海洋中最丰富的微生物之一。它们通过氧化氨获取能量，在此过程中意外产生温室气体氧化亚氮（N₂O）。目前关于AOA氮代谢的酶学细节仍缺乏系统研究。

近期，美国康奈尔大学的研究团队在PNAS上发表了题为“Nitrous oxide production via enzymatic nitroxyl from the nitrifying archaeon Nitrosopumilus maritimus”的研究论文，研究团队发现了一种独特的酶（Nmar_1354），该酶通过将专性硝化中间产物羟胺（NH2OH）的氧化与氧气（O₂）还原耦合，选择性生成亚硝基（HNO）。尽管该化合物会经历多个下游反应，但其主要去向是通过与羟胺反应生成氮气（N₂），以及自身二聚化形成N₂O。这些发现为AOA释放N₂O提供了合理的酶学机制解释。

传统认知中，细菌通过血红素酶（HAO）途径产N₂O。但基因组分析显示，氨氧化古菌完全缺乏这类关键基因。更奇怪的是，它们体内携带大量多铜氧化酶（MCOs），暗示着一条全新的代谢路径。

研究团队锁定了一种特殊酶——Nmar_1354。这种来自海洋古菌Nitrosopumilus maritimus的多铜氧化酶，结构独特，带有罕见的"悬挂式"铜结合域。为验证其功能，研究团队使用英国Hansatech的Clark液相氧电极测定系统（Oxygraph+）。该仪器能实时监测溶液中溶解氧的变化，分辨率可以达到^10-3pmol/ml，成为破解细胞呼吸、线粒体呼吸和酶活性的关键“侦测器”。

图1 Nmar_1354晶体结构

研究人员重组表达并纯化了Nmar_1354，并通过多种光谱手段确认了其铜中心的正确组装。核心问题是：它能催化什么反应？与N₂O产生有关吗？

图2 Nmar_1354催化NH₂OH氧化产生HNO、N₂O和N₂

图S7 使用6µM Nmar_1354和_{[NH2OH]0 = 20 mM}的代表性呼吸测量曲线。

在有氧条件下，Oxygraph+的检测结果发现，Nmar_1354能有效催化消耗O₂，反应速率随NH₂OH浓度增加而逐渐饱和（图2A，S7）。动力学模型分析得出：Vmax = 0.83 ± 0.1µM⁻¹s⁻¹，Km = 22 ± 5 mMNH₂OH， Kcat = 0.3 ± 0.1 s⁻¹， Kcat/KM = 13.6 ± 0.5 M⁻¹s⁻¹。实时质谱（DEMS）显示，当加入¹⁵N标记的NH₂OH时，O₂消耗伴随着产物¹⁵N¹⁵N和¹⁵N¹⁵NO（即¹⁵N₂和¹⁵N₂O）的同步生成（图2D）。O₂耗尽，反应停止，证明O₂是必需的电子受体。气相色谱-质谱联用技术检测证实Nmar_1354催化反应的主要气体产物之一是N₂O（图2B红点）。其产量随初始NH₂OH浓度增加，但非化学计量（即不是每消耗一份NH₂OH就产生固定量的N₂O）。

图S8 使用5µM硫酸铜和[NH2OH]0 = 10 mM的代表性呼吸测量曲线。

使用游离Cu²⁺（CuSO₄）也能催化NH₂OH产生N₂O（Fig. S8），但此反应可被EDTA完全抑制。而Nmar_1354的催化活性不受EDTA影响，证明是酶本身的活性，而非污染物金属离子。另一种MCO（大肠杆菌CuEO）对NH₂OH无活性（Fig. S9），说明此功能并非所有MCO共有。

图S9 使用10µM CuEO和30 mM羟胺的代表性呼吸测定曲线

该反应是否产生了假说中的中间体——亚硝基（HNO）？HNO极不稳定，易二聚成N₂O或与NH₂OH反应生成N₂。研究人员使用了一种荧光探针P-CM。该探针能特异性与HNO反应，发出强烈荧光。在包含Nmar_1354和NH₂OH的反应体系中加入P-CM后，荧光强度显著增强了3.6倍（图2C）。这提供了强有力的间接证据，表明反应中确实产生了HNO！

反应方程式：

2NH₂OH + O₂ → 2HNO + 2H₂O

Nmar_1354催化此反应，将NH₂OH选择性氧化为HNO，同时还原O₂。产生的HNO极不稳定，会迅速发生多种反应：

二聚化：2HNO → N₂O + H₂O；主要产生N₂O。

与NH₂OH反应：HNO + NH₂OH → N₂ + 2H₂O；主要产生N₂（图2D中检测到的¹⁵N¹⁵N来源）。

与O₂反应：HNO + O₂ → ONOO⁻；最终分解为硝酸盐（NO₃⁻）。实验检测到约40 μM NO₃⁻生成，与模型预测一致。

本研究是微生物氮循环和金属酶学领域的重要突破。它不仅阐明了海洋温室气体N₂O的一个重要生物来源，揭示了古菌独特的代谢策略，还首次在酶学水平上捕捉到了神秘分子HNO的生成。理解这些微观过程的细节，对于精准构建氮循环和温室气体排放模型，最终应对气候变化挑战，具有深远的意义。