新国标应对—GB 5009.299-2024 食品中乳铁蛋白的测定

1. 本试验参考 GB 5009.299-2024、NY/T 4439-2023 以及相关团体标准和企业标准，对巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳和婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的含量进行测定。

2. 为获得良好的峰形和分离度，试验对样品前处理和液相色谱条件进行了适当优化，在柱温 30 ℃、流速 1.0 mL/min 条件下，以 0.1% 三氟乙酸水-0.1% 三氟乙酸乙腈 作为流动相进行梯度洗脱，系统最大压力值不超过 106 bar。

3. 试验结果表明：乳铁蛋白标准品溶液 (50.0 μg/mL) 色谱峰不对称因子 1.00，峰形良好，理论塔板数 30549，柱效优异；连续三次进样，保留时间和峰面积的 RSD 均小于 1%，方法重现性好；线性低点 (1.00 μg/mL) 信噪比为 8.2，方法灵敏度较高；线性范围 1.00-200 μg/mL，线性相关系数 r²≥0.9998，线性良好。

4. 在反相液相色谱法测定乳制品中乳铁蛋白含量的试验中，BioBasic 4 色谱柱（孔径 300 ?）配合 Vanquish Core 高效液相色谱系统，表现出了良好的重现性和优异的稳定性，方法检出限和定量限均满足标准要求，可供乳制品企业及食品检测实验室参考。

1.1 试样提取

1.1.1 液体试样：低温奶（生牛乳、巴氏杀菌乳）/ 常温奶（超高温 (UHT) 灭菌乳）

称取试样 5 g（精确到 0.1 mg）于 50 mL 带刻度旋盖离心管中，用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至 25.0 mL，涡旋振荡提取 3 min，12000 rpm 4 ℃ 离心 15 min。室温静置，去除上层浮脂，取上清液待净化。

1.1.2 固体试样：乳粉（婴幼儿配方奶粉）

称取试样 2 g（精确到 0.1 mg）于 50 mL 带刻度旋盖离心管中，加适量磷酸盐缓冲液Ⅱ温热振摇溶解，用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至 50.0 mL，涡旋震荡提取 3 min ，静置 30 min 以上，12000 rpm 4 ℃ 离心 15 min。室温静置，去除上层浮脂，取上清液待净化。

1.2 试样净化

1.2.1 活化：HyperSep 肝素亲和柱 (P/N: 60105-110-B) 下端 Luer 接头连接至固相萃取装置，上端通过适配器 (P/N: 60104-259) 串联 10 mL 注射器空筒， 加入 2×5 mL 磷酸盐缓冲液Ⅱ活化肝素亲和，控制滴速 2d/3s；

1.2.2 上样：待活化步骤液面接近小柱筛板时，准确移取 10.0 mL 上述样液至注射器空筒 (P/N: S7510-10) 中，控制滴速 2d/3s，弃去流出液；

1.2.3 淋洗：待上样步骤液面接近小柱筛板时，加入 2×5 mL 磷酸盐缓冲液Ⅱ淋洗小柱，弃去流出液，移除适配器和注射器空筒，负压抽干小柱 2 min；

1.2.4 洗脱：加入 2×2.5 mL 磷酸盐缓冲液Ⅰ洗脱，收集全部洗脱液，并用磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至 5.00 mL，过 0.2 μm 亲水性 PTFE 针式过滤器 (P/N: 42213-NPL) ，滤液待上机测试。

Thermo Scientific? Vanquish Core? 高效液相色谱系统，配置：泵 Quaternary Pump C (VC-P20-A)，自动进样器 Split Sampler CT (VC-A12-A)，柱温箱 Column Compartment C (VC-C10-A)，检测器 Diode Array Detector CG (VC-D11-A)，数据处理 Chromeleon? 7.3

色谱柱：BioBasic 4, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 72305-254630)

流动相：A: 0.1% 三氟乙酸水 B: 0.1% 三氟乙酸乙腈

流速：1.0 mL/min

梯度洗脱程序：

进样量：50 μL

柱温：30 ℃

检测器：DAD, 采集波长: 280 nm；采集频率: 5 Hz；光谱采集: 190-400 nm