探索未至之境 | ZenoTOF 8600 超敏质谱解码生物药研究的深度“未知域”

相比上一代高分辨质谱系统，ZenoTOF 8600系统灵敏度提升10倍，在碰撞诱导解离（CID）或电子活化解离（EAD）碎裂DDA模式下，即使极低样本量仍能实现高质量肽图数据。

灵敏度提升使得低丰度质量属性（如序列变异SVs、色氨酸氧化产物及其他翻译后修饰PTMs）的检测与鉴定成为可能。

电子活化解离（EAD）技术可获得PTMs精确定位，并明确区分氨基酸异构体。

CID与EAD技术相互补充，为二硫键定位提供更可靠的数据支持。

ZenoTOF 8600系统通过对离子源、光学系统和检测器的全面升级，使其MS灵敏度较ZenoTOF 7600系统提升高达10倍，这一突破性进展为生物治疗药物中低含量工艺相关杂质（PQAs）及降解产物高灵敏检测与精准鉴定提供了显著的技术优势。如图1所示，在NIST mAb序列覆盖分析的实验中，当样品量仅为100 ng条件下，ZenoTOF 8600系统即可实现NIST mAb重链（HC）和轻链（LC）94-99%序列覆盖（图1）。而相同条件下， ZenoTOF 7600系统的序列覆盖度低于96%。值得注意的是，在进行CID或EAD碎裂模式的DDA分析，ZenoTOF 8600系统的肽段鉴定数量较ZenoTOF 7600系统提升达2倍。这一优势性能尤其表现在对低丰度翻译后修饰、序列变异体等传统表征难题的解析能力上。

序列变异体（Sequence Variants, SVs）的产生机制主要包括：宿主细胞系的基因突变或翻译错误，生物反应器进料异常或者固有的生物噪声。这类序列变异体的识别和量化极具挑战性，尤其是对低丰度序列变异体的分析。如图2所示，针对NIST mAb中的肽段VVSVLTVLHQDWLNGK及其序列变异体V→Xle （Xle = Ile 或 Leu）的分析表明，在相同进样量条件下，ZenoTOF8600系统相比ZenoTOF 7600系统可实现最高超过6倍以上信噪比（S/N）提升。这一显著的性能改进使得系统能够有效检测到传统技术难以识别的极低丰度（<0.1%）序列变异体，为生物药物质量控制的严格标准提供了强有力的技术支撑。

图3展示了肽段VVSVLTVLHQDWLNGK在V308和V311位点发生取代所产生的两种低丰度序列变异体（SVs）的分析结果，包括提取离子色谱图（XIC）和电子激活解离（EAD）质谱图。尽管这两种序列变异体的含量极低（<0.1%），EAD技术仍能产生丰富的碎片离子，为序列变异体的可靠鉴定可通充分的质谱证据。同时高质量的EAD谱图数据不仅实现对低含量变异体的检测，更成功区分了发生在相邻位点（V308 vs V311）的结构异构体。这一结果充分展现了ZenoTOF 8600系统结合EAD技术在复杂生物药物表征中的独特优势：既能突破传统检测限的束缚，又能提供足够的结构解析力来解决最棘手的序列变异体定位难题。

EAD技术作为一种区别于CID的碎裂模式，在翻译后修饰分析展现独特优势，其通过选择性断裂肽段骨架中α碳-氮键（Cа-N），能够完整保留易发生中性丢失的修饰基团（如糖基化），从而实现对修饰位点的精确定位。如图4所示，针对肽段VVSVLTVLHQDWLNGK及其色氨酸（W）氧化产物的分析表明，即使面对极低含量（<0.01%）且存在同分异构体的复杂体系，ZenoTOF 8600系统结合优化后的肽图分析流程实现卓越的检测性能。该系统不仅成功鉴定了多种色氨酸氧化产物，包括单氧化（Ox）、双氧化（Diox）及色氨酸→犬尿氨酸（W→Kynurenin）转化产物等，更实现了低至0.006%的超微量的色氨酸氧化产物高灵敏检测，其检测性能显著优于前一代平台。此外，如图5所示，EAD即使对这些低丰度氧化产物以及其他的翻译后修饰（如氧化修饰、糖基化修饰和糖化修饰）均能产生丰富的碎片离子，这种全面的碎裂特征不仅保障了修饰肽段的准确鉴定，更重要的是通过特征性诊断离子实现了修饰位点的确认，为生物治疗药物的深度表征建立了新的技术标准。

EAD技术在氨基酸同分异构体鉴别方面同样具有独特优势，其产生特征性的诊断碎片用于区分氨基酸同分异构体，如天冬氨酸（Asp, D）和异天冬氨酸（isoAsp, isoD），亮氨酸(Leu)与异亮氨酸(Ile)。如图6所示，针对脱酰胺化产物及异天冬氨酸（iso D）修饰的分析中，凭借ZenoTOF 8600系统灵敏度的显著提升，使得低至0.2%-0.4%丰度的同分异构体诊断性碎片检测成为可能（图6）。此外，EAD技术产生诊断性z-57碎片离子确证了肽段中iso D修饰的存在。

CID 和 EAD 技术各具特色，在肽段鉴定分析形成优势互补。CID技术可提供稳定的 b/y 型碎裂离子，而EAD技术通过独特的碎裂机制产生丰富的碎片离子以及能特异的断裂二硫键，为二硫键连接的肽段鉴定提供可靠的证据。ZenoTOF 8600系统凭借质谱灵敏度提升，使得低丰度二硫键连接肽段能够被灵敏检测和鉴定，显著提高了二硫键定位的可信度。如图7所示，通过对NIST mAb非还原酶切样本中的二硫键连接肽段的分析，EAD产生丰富的碎片离子实现肽段序列高覆盖，同时成功解析传统方法难以鉴定的二硫键连接肽段。这一技术突破为单克隆抗体等生物药物的高级结构确证和质量控制提供了强有力的工具，特别是在二硫键网络解析这一关键质量属性分析方面具有重要应用价值。