「翘客」技术手册：解锁血管危机预警信号：MMP-9的荧光现形记

研究背景

生物标志物

血管系统是人体的生命枢纽，其健康状态取决于血管内皮细胞的功能稳态。内皮细胞作为血管壁的“第一道防线”，在遭遇炎症、缺氧、代谢异常等危机时，会释放特异性预警信号。其中，MMP-9（基质金属蛋白酶，又称为明胶酶B）是反映血管损伤与重塑的核心分子标志物，而CD31（即血小板内皮细胞黏附分子-1，PECAM-1）则是精准定位内皮细胞的特异性生物标志物。二者的协同检测是评估血管病理状态的关键技术路径。

MMP-9：动态时间表

MMP-9作为基质金属蛋白酶家族的核心成员，以无活性的92 kDa酶原形式（pro-MMP-9）储存于内皮细胞中，在血管面临危机时被快速激活。炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1β）、缺氧、高糖等因素，会促使内皮细胞大量分泌MMP-9。激活后的MMP-9可精准降解血管基底膜的Ⅳ型胶原、明胶等核心成分，同时调控血管内皮生长因子（VEGF）等信号分子的活性。

MMP-9的表达水平具有明确的病理指示意义。在动脉粥样硬化早期，MMP-9的轻度升高提示内皮屏障受损。当斑块进入不稳定期，MMP-9会呈爆发式表达，加速斑块破裂风险。在糖尿病微血管病变、高血压肾损伤等疾病中，MMP-9的异常波动直接反映血管重塑的严重程度。捕捉MMP-9的表达变化，相当于掌握了血管危机的“动态时间表”。

CD31：特异性身份标签

CD31是一种跨膜糖蛋白，分子量约130 kDa，是内皮细胞的特异性生物标志物。CD31仅高表达于血管内皮细胞连接处及少量血小板、白细胞表面，在成熟内皮细胞中的表达具有高度稳定性。

CD31的核心作用是精准定位。在复杂的细胞群体或组织样本中，CD31可像荧光标签一样标记出内皮细胞的轮廓，排除成纤维细胞、平滑肌细胞等其他细胞的干扰，确保后续检测到的MMP-9信号均来自内皮细胞，避免因信号混杂导致的误判。

简而言之，以CD31为“定位标”、荧光免疫技术为检测手段，靶向捕捉内皮细胞MMP-9的“预警信号”，不仅是基础科研的重要手段，更是连接血管分子机制与临床诊疗的关键桥梁。这也是本次实验的核心意义所在。

一、实验原理

本实验采用间接免疫荧光法，利用“CD31特异性标记内皮细胞联合MMP-9特异性检测目标分子”的双重标记策略：

1.一抗孵育：将抗CD31一抗（标记内皮细胞）与抗MMP-9一抗（识别目标分子）共同孵育样品，使一抗分别与细胞表面的CD31和细胞内/外的MMP-9特异性结合；

2.  荧光二抗孵育：加入两种不同荧光素标记的二抗（如抗CD31一抗对应Cy3荧光二抗，抗MMP-9一抗对应FITC荧光二抗），二抗与对应的一抗特异性结合，实现对CD31和MMP-9的荧光标记；

3.  荧光检测：通过荧光显微镜观察，CD31阳性（红色荧光信号）的细胞为内皮细胞，在该细胞群体中，MMP-9的绿色荧光强度反映其表达水平。

二、实验材料与试剂

（一）样品准备

待检测样品：原代培养的血管内皮细胞

样品处理试剂：PBS缓冲液（pH 7.4）、4%多聚甲醛固定液、0.1% Triton X-100通透液（用于检测细胞内MMP-9）、5% BSA封闭液（含0.1% Tween-20）

（二）抗体试剂

一抗：

鼠抗人CD31单克隆抗体（购自义翘神州，Cat: 10148-MM28）

兔抗人MMP-9多克隆抗体（购自义翘神州，Cat: 80049-T24）

二抗：

荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗（FITC标记，激发波长488 nm，发射波长525 nm）

荧光素标记的山羊抗鼠IgG二抗（Cy3标记，激发波长550 nm，发射波长570 nm）

抗体稀释液：

含1% BSA的PBS缓冲液（pH 7.4）

（三）其他试剂

抗荧光淬灭封片液（含DAPI，用于细胞核染色，便于细胞定位）

（四）实验器材

荧光显微镜

细胞培养箱、离心机、移液器、载玻片、盖玻片

湿盒（孵育用，防止抗体干燥）、染色缸

三、实验步骤

（一）样品预处理

1，制备细胞爬片：将内皮细胞接种于预先铺有盖玻片的6孔板中，培养至细胞融合度达70%-80%时进行后续处理。

2，固定：吸弃培养基，用PBS冲洗细胞3次（每次5 min），加入4% 多聚甲醛固定液，室温固定15-20 min。

3，通透：固定后用0.1% Triton X-100（PBS配制）室温通透10 min，再用PBS冲洗3次。

4，封闭：加入5% BSA封闭液，室温封闭30-60 min，阻断非特异性结合位点。

（二）一抗孵育

1，抗体稀释：用抗体稀释液将抗CD31一抗和抗MMP-9一抗分别稀释至工作浓度（CD31 1:500，MMP-9 1:200）。

2，孵育：吸弃封闭液，将稀释后的两种一抗混合液均匀滴加在细胞爬片上（确保覆盖所有细胞），放入湿盒中4℃孵育过夜。

3，洗涤：次日取出爬片，吸弃一抗溶液，用含0.1% Tween-20的PBST冲洗3次，每次5 min，去除未结合的一抗。

（三）二抗孵育

1，二抗稀释：根据一抗种属选择对应的荧光二抗，用抗体稀释液稀释至工作浓度（1:500）。

2，避光孵育：吸弃PBST，将稀释后的荧光二抗混合液滴加在爬片上，湿盒中室温避光孵育1 h。

3，洗涤：用PBST冲洗3次（每次5 min），最后用PBS冲洗1次，去除未结合的二抗。

（四）细胞核染色与封片

1，细胞核染色：滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片液，室温避光孵育5 min，对细胞核进行染色。

2，封片：吸去多余封片液，将爬片倒扣在载玻片上（细胞面朝下），避免产生气泡，室温晾干后避光保存。

四、结果观察与分析

1，显微成像

使用荧光显微镜，分别选择对应荧光素的激发波长（FITC：488 nm，Cy3：550 nm，DAPI：350 nm），观察并拍摄图像；

2，结果判读

阳性结果：DAPI染色显示蓝色细胞核，MMP-9阳性细胞表现为绿色荧光（FITC），CD31阳性表现为红色荧光（Cy3）；在CD31阳性的内皮细胞中，绿色荧光的有无及强度直接反映MMP-9的表达情况（如图）；

图3 内皮细胞中MMP-9的表达水平（标尺大小为100μm）

五、注意事项

1，样品处理：细胞固定时间不宜过长，避免抗原变性影响检测结果。

2，抗体选择：确保一抗CD31和MMP-9的种属不同，如本实验中CD31为鼠源，MMP-9为兔源，避免二抗交叉反应。优先选用高特异性验证抗体，减少非特异性结合。

3，抗体浓度优化：不同批次抗体的最佳工作浓度可能不同，实验前需进行梯度稀释预实验，选择荧光信号强、背景低的浓度。

4，荧光稳定性：荧光素易受光照降解，二抗孵育及后续步骤需全程避光，封片后样品需在4℃避光保存，并尽快观察。

5，充分洗涤：每次孵育后需充分洗涤，去除未结合的抗体，降低背景荧光。

实验方案来自产品使用征文大赛用户投稿，仅供学习交流。产品咨询：请联系义翘神州小助手（微信：sinobio2023）或公众号留言。