抗体酵母展示技术平台

2024-01-15 10:33:24 149阅读次数

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泰克生物着力于为客户提供高质量，且具性价比的抗体药物前期发现技术服务。我们在药物抗体发现方面拥有10年的项目开发经验和心得，积累了充足的抗体定制和重组蛋白生产经验。基于酵母体展示技术（Yeast Display Technology）平台的服务，泰克生物能够为客户提供一系列包括但不限于兔源、鼠源、羊源、驼源等不同物种的单克隆抗体制备服务，及其配套的完整可追溯性文件体系。

酵母抗体展示技术（Yeast Display Technology）是指用抗体序列可变区与凝集素Aga2p融合表达，Aga2p蛋白亚基通过两个二硫键与固定在酵母细胞壁上的Aga1p 蛋白亚基结合，结合流式分选技术，将靶向抗原的特异性抗体给筛选出来。

█ 酵母展示抗体文库构建服务

泰克生物可为客户提供来自驼源VHH纳米抗体库，以及其他物种scFv形式抗体的酵母展示文库构建及筛选服务。VHH纳米抗体库，又称为驼源重链抗体文库，抗体分子量大小为15kDa，是驼源动物产生的特有的一种抗体。酵母抗体文库展示体系受限于自身物理特性限制，物理库容滴度一般<107，因此主要应用于客户对项目库容要求不高，动物免疫后PBMC细胞经过二次分选以及避免漏掉二硫键形成的抗体发现项目。同时酵母展示文库相对噬菌体展示文库技术而言，前者在微量抗体表达后抗体活性层面相较于后者要高，得益此基础，在流式筛选时就能区分抗体的亲和力高低。

目前被广泛应用于CAR-T/CAR-NK治疗性抗体，主要以驼源VHH抗体（又被称为纳米抗体）发现为主，VHH/scFv抗体酵母展示发现路径如图1所示：

企业微信截图_16697909976943.png

图1基于酵母技术平台的VHH/scFv抗体发现服务

█ 服务内容和周期

步骤	服务内容	QC标准	周期
Step1:蛋白表达	(1) 密码子优化+基因模板合成+表达载体构建； (2) 质粒抽提+转染（哺乳表达系统）目的蛋白检测（WB，SDS-PAGE）； (3) 蛋白表达放大+蛋白亲和纯化；	交付：表达载体，克隆甘油菌，重组蛋白3-3.5mg，纯度>85%，标准实验报告	4-6周
Step2:动物免疫	(1) 动物免疫4次，加强免疫一针，共计免疫5针； (2) 免疫前采集阴性血清，第4针采血进行ELISA检测血清效价； (3) 若第4针血清抗体效价（蛋白抗原>105；多肽抗原>104）满足要求，则采血前7天再次加强免疫1针，如不满足要求，则继续常规免疫； (4) 效价合格，采血分离单核细胞；	动物：背景清晰（年龄，性别，防疫情况）；免疫：蛋白抗原>105；多肽抗原>104；采血：数量100ml以上； PBMC细胞：>105/vial	8-10周
Step3:模板cDNA制备	(1) PBMC总RNA提取（RNA提取试剂盒） (2) 高保真RT-PCR制备cDNA（反转录试剂盒）	cDNA：反转后>1ug/ul，胶图分布均匀； cDNA模板总量>150ug；	1 天
Step4:抗体酵母展示文库构建	(1) 以cDNA为模板，两轮PCR扩增VHH基因酵母表达质粒构建与转化： VHH基因拼接酵母展示载体，电击转化酵母宿主菌，构建抗体库，电击次数不低于10次鉴定：随机挑选24个克隆，PCR鉴定阳性率+PCR鉴定多样性+插入率	文库阳性率：>90%；文库插入性率：>90%；库容：>106	1-2周
Step5:文库筛选（磁珠+Facs）	(1) 磁珠分选； (2) FACS分选（免疫双标分选）； (3) 铺板+阳性克隆菌培养+抗体基因测序；（>20个，多达96个）；	阳性标准：双阳性菌株； VHH筛选标准：CDR氨基酸序列不同	2-3周
Step6:抗体验证（体外验证）	(1) 将获得的抗体序列构建合适的表达载体进行表达+亲和纯化+抗体蛋白定量； (2) Elisa验证抗体与抗原结合，进行下游验证（交付EC50数据）; (3) BLI法验证抗体亲和力； (4) 细胞功能验证：流式验证； (5) 验证细胞系（抗原受体过表达细胞系）；	交付：表达载体，克隆菌株，表达菌株，重组抗体蛋白1mg，纯度90%；快速亲和力测定结果；	4-6周