近年来，随着基因治疗领域的飞速发展，腺相关病毒(AAV)因其独特的优势，如能够感染分裂和非分裂细胞、产生长期基因表达、低毒性和低免疫原性，已成为该领域最重要的基因载体之一。近日，中国食品药品检定研究院的研究团队与合作，在《中国生物制品学杂志》上发表了一项重要研究，利用反相液相色谱-质谱联用技术(RPLC-MS)对重组腺相关病毒6型(rAAV6)的衣壳蛋白进行了全面表征分析，为AAV基因治疗制品的质量控制及生产工艺的提升提供了有力支持。
AAV是一种细小病毒，其衣壳由三种蛋白（VP1、VP2和VP3）的60个亚基组成，这些蛋白以约1:1:10的摩尔比存在，并共享重叠序列。不同血清型的AAV衣壳蛋白具有不同的同源性和组织嗜性，这些特性直接影响病毒载体的感染活性和组织靶向性。因此，对rAAV载体衣壳蛋白的表征分析对于确保基因治疗产品的安全性、有效性和批间一致性至关重要。
研究团队采用了RPLC-MS联用技术，通过优化流动相、柱温和梯度洗脱条件，结合ESI-Q-TOF质谱检测，对rAAV6的衣壳蛋白进行了精确分析。
通过RPLC-MS分析，研究团队成功测定了rAAV6衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的完整相对分子质量，分别为81255.9、66062.9和59488.6 Da，与理论值的偏差分别为8.1 ppm、3.8 ppm和36 ppm。如图1和图2所示，采用DFA作为流动相改性剂相较于甲酸改性剂，在色谱分离过程中实现了对亚基之间更为优越的分离效果，使得我们能够观察到更加丰富的亚基形式。表1展示了rAAV6衣壳蛋白分子量表征结果。
图1. 相对分子量测定总离子流(total ion chromatogram，TIC)图谱。
图2. rAAV6衣壳蛋白相对分子质量检测质谱图（上：VP1蛋白相对分子质量结果示例；C：VP2蛋白相对分子质量结果示例）。
进一步的酶切后质量肽图分析显示，样品序列覆盖率达到约89%，检测到的翻译后修饰(PTM)主要包括脱酰胺、脱酰胺化琥珀酰亚胺、N-末端乙酰化、泛素化和磷酸化，未观察到糖基化修饰等其他翻译后修饰(PTM)类型。如图3所示，串联质谱分析还确证了rAAV6衣壳蛋白的N-末端序列、C-末端序列及其N-末端的PTM。肽图检测修饰汇总见表2。
图3. 各碎片离子匹配图示例。
表2. rAAV6肽图检测修饰汇总。
本研究使用RPLC‐MS对预处理后的rAAV衣壳蛋白直接进行分析，建立了以DFA作为流动相改性剂对衣壳蛋白进行相对分子质量检测的方法，获得了较好的分离效果。在溶液内对衣壳蛋白进行胰蛋白酶(Trypsin)消化后，通过LC‐MS／MS进行肽图详细表征，鉴定了VP1、VP2和VP3中N‐末端和C‐末端序列，以及各种翻译后修饰。
本研究建立了AAV6衣壳蛋白的深度表征液质分析方法，质谱技术可应用于不同批次产品、不同生产工艺一致性的评价分析，对AAV基因治疗制品的质量属性研究及生产工艺监控和提高具有积极的借鉴意义。未来，随着技术的不断进步，RPLC-MS联用技术有望在更多生物制药领域发挥重要作用，推动基因治疗等前沿技术的快速发展。
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