反转录病毒介导Luciferase基因稳定转染细胞株构建及生物发光成像研究

引言

反转录病毒作为一种高效的基因传递工具，广泛应用于基因治疗和基因功能研究。Luciferase基因作为一种常用的报告基因，其表达可以通过生物发光成像技术进行实时监测。本研究通过反转录病毒介导的基因转染技术，构建了稳定表达Luciferase的细胞株，并利用生物发光成像技术对其进行了验证。该研究为后续的活体成像研究提供了可靠的实验材料。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 细胞培养

实验所用细胞为某品牌提供的HEK293T细胞和HeLa细胞。细胞培养于含10%胎牛血清（某试剂）DMEM培养基（某试剂）中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.2 反转录病毒载体构建

将Luciferase基因克隆至某品牌提供的反转录病毒载体pMXs中，构建重组质粒pMXs-Luc。通过某品牌提供的DNA提取试剂盒提取质粒DNA，并进行测序验证。

1.3 病毒包装与感染

将pMXs-Luc质粒与包装质粒pCL-Ampho（某试剂）共转染至HEK293T细胞中，使用威尼德电穿孔仪进行电穿孔转染。转染48小时后，收集上清液，过滤后获得病毒液。将病毒液感染HeLa细胞，加入8 μg/mL的Polybrene（某试剂）以提高感染效率。

1.4 稳定转染细胞株筛选

感染48小时后，将细胞传代至含2 μg/mL嘌呤霉素（某试剂）的培养基中进行筛选。筛选2周后，获得稳定表达Luciferase的HeLa-Luc细胞株。

1.5 生物发光成像分析

将HeLa-Luc细胞接种于96孔板中，每孔接种1×10^4个细胞。加入某品牌提供的Luciferase底物（某试剂），使用威尼德分子杂交仪进行生物发光成像分析。成像条件为曝光时间1分钟，增益设置为中等。

2. 结果与讨论

2.1 反转录病毒载体构建与验证

通过测序验证，成功构建了pMXs-Luc重组质粒。电泳结果显示，重组质粒大小与预期一致，表明Luciferase基因正确插入至反转录病毒载体中。

2.2 病毒包装与感染

病毒包装后，通过荧光显微镜观察，发现HEK293T细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达，表明病毒包装成功。感染HeLa细胞后，通过嘌呤霉素筛选，获得了稳定表达Luciferase的HeLa-Luc细胞株。

2.3 生物发光成像分析

生物发光成像结果显示，HeLa-Luc细胞在加入Luciferase底物后，能够产生明显的生物发光信号。随着细胞数量的增加，发光强度呈线性增加，表明Luciferase基因在HeLa-Luc细胞中稳定表达。

3. 结论

本研究成功构建了反转录病毒介导的Luciferase基因稳定转染细胞株，并通过生物发光成像技术验证了其表达。该细胞株具有稳定的生物发光特性，适用于后续的活体成像研究。本研究为基因功能研究和药物筛选提供了可靠的实验材料。

详细实验步骤

1. 细胞培养

1.1 将HEK293T细胞和HeLa细胞分别接种于10 cm培养皿中，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。

1.2 置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，每隔2-3天传代一次。

2. 反转录病毒载体构建

2.1 设计并合成Luciferase基因的特异性引物，通过PCR扩增Luciferase基因。

2.2 将PCR产物克隆至pMXs载体中，构建重组质粒pMXs-Luc。

2.3 使用某品牌提供的DNA提取试剂盒提取质粒DNA，并进行测序验证。

3. 病毒包装与感染

3.1 将pMXs-Luc质粒与包装质粒pCL-Ampho共转染至HEK293T细胞中。

3.2 使用威尼德电穿孔仪进行电穿孔转染，转染条件为电压250 V，电容950 μF，电阻∞。

3.3 转染48小时后，收集上清液，通过0.45 μm滤器过滤，获得病毒液。

3.4 将病毒液感染HeLa细胞，加入8 μg/mL的Polybrene以提高感染效率。

4. 稳定转染细胞株筛选

4.1 感染48小时后，将细胞传代至含2 μg/mL嘌呤霉素的培养基中进行筛选。

4.2 筛选2周后，获得稳定表达Luciferase的HeLa-Luc细胞株。

5. 生物发光成像分析

5.1 将HeLa-Luc细胞接种于96孔板中，每孔接种1×10^4个细胞。

5.2 加入某品牌提供的Luciferase底物，使用威尼德分子杂交仪进行生物发光成像分析。

5.3 成像条件为曝光时间1分钟，增益设置为中等。

讨论

本研究通过反转录病毒介导的基因转染技术，成功构建了稳定表达Luciferase的HeLa-Luc细胞株。生物发光成像分析结果表明，该细胞株具有稳定的生物发光特性，适用于后续的活体成像研究。本研究为基因功能研究和药物筛选提供了可靠的实验材料。

结论

反转录病毒介导的Luciferase基因稳定转染细胞株，并通过生物发光成像技术验证了其表达。该细胞株具有稳定的生物发光特性，适用于后续的活体成像研究。本研究为基因功能研究和药物筛选提供了可靠的实验材料。

参考文献

1. 大鼠脑胶质瘤荧光素酶动物模型建模细胞株C6-Luc的构建[J].黄伟;吕明;李保卫;王玉丽;邵荣光;高钟镐,解放军医学杂志.2011,第1期

2. 荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较[J].李小颖;高凯;董伟;张连峰,中国比较医学杂志.2011,第3期

3. 用于活体成像的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建[J].王珂;谢四梅;何建军;任予;夏海滨;张新伟,南方医科大学学报.2011,第11期

4. Advances in bioluminescence imaging of live animal models[J].Flentie; Kelly;Moss; Britney;Dothager; Robin S;Pan; Mei-Hsiu,Current Opinion in Biotechnology.2009,第1期

5. Advances in imaging mouse tumour models in vivo.[J].Lyons SK,Journal of Pathology: Journal of the Pathological Society of Great Britain & Ireland.2005,第2期

6. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.[J].Christopher H; Contag;Michael H; Bachmann,Annual review of biomedical engineering.2002,第5期

7. Bioluminescence Imaging Captures the Expression and Dynamics of Endogenous p21 Promoter Activity in Living Mice and Intact Cells[J].White; Lynn S.;Piwnica-Worms; Helen;Sun; Jinwu;Tinkum; Kelsey L.;Marpegan; Luciano;Piwnica-Worms; David;Herzog; Erik D.,Molecular & Cellular Biology.2011,第18期

8. Imaging of embryonic stem cell migration in vivo.[J].Andrew S; Lee;Joseph C; Wu,Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).2011,第6期

9. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function.[J].de Almeida; Patricia E.;van Rappard; Juliaan R. M.;Wu; Joseph C.,American Journal of Physiology: Heart & Circulatory Physiology.2011,第3期