疫苗佐剂（CpG1018）的制备纯化工艺

2024-10-17 11:36:39 34阅读次数

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随着生物技术的飞速发展，疫苗佐剂作为提升疫苗效力、减少接种剂量及拓宽免疫反应谱的关键组分，其市场需求日益凸显。

全球范围内，政府对疫苗研发的重视和政策支持为疫苗佐剂市场提供了良好的发展环境。同时，公众健康意识的提升和疫苗接种率的增加，也为疫苗佐剂市场带来了强劲的市场需求。

为适应新型疫苗需求，佐剂已从传统单一的形式向新型多元化形式发展，新型佐剂已在多种疫苗中成功应用。纳米技术、基因编辑技术、人工智能等前沿科技的融合应用，正不断拓宽佐剂设计的边界。其中，微生物核酸类新型佐剂如寡脱氧核苷酸(CpGODN)展现出显著优势，其能够增强疫苗的免疫原性，提高免疫效果。此外，还在抗癌、抗病毒、治疗心血管疾病及糖尿病等领域展现出广阔的应用前景。

CpG-ODN疫苗佐剂概述

疫苗佐剂包括传统佐剂和新型佐剂。

传统佐剂如铝佐剂、油乳佐剂；新型佐剂包括：脂质体佐剂、细胞因子佐剂、微生物衍生物型佐剂、纳米佐剂和多糖佐剂等。其中，寡脱氧核苷酸CpG-ODN佐剂属于微生物核酸类佐剂，对淋巴细胞具有很好的刺激活性，能够直接激活单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈细胞，并刺激这些细胞分泌细胞因子。相对于传统佐剂，如铝佐剂，CpG佐剂能够诱导更强的Th1型细胞免疫反应，对于某些疾病（如病毒感染）的预防具有重要意义。

CpG-ODN疫苗佐剂是一种重要的免疫增强剂，其全称为胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（Cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotides），该类佐剂由特定序列的未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）DNA片段组成，属于TLR9激动剂。

其作用机制包括：

TLR9识别：CpG佐剂通过被免疫细胞（如树突状细胞、B细胞等）表面的Toll样受体9（TLR9）识别，从而激活下游信号通路。

细胞因子释放：激活TLR9后，细胞释放多种细胞因子（如IFN-α、IL-6、TNF-α等），促进免疫细胞的活化和增殖。

免疫反应增强：通过促进树突状细胞的成熟和抗原递呈能力，以及增强B细胞和T细胞的反应，从而提高机体的免疫反应。

由于能够有效地诱导先天免疫反应，并有助于适应性免疫，因此它们作为疫苗佐剂的潜在应用备受关注。Dynavax 公司以CpG序列1018为佐剂，HBsAg为抗原的HBV疫苗，已于2017年被FDA批准上市。

CpG-ODN 1018 结构信息如下：

CpG-ODN1018疫苗佐剂

制备纯化工艺

本案例通过如下四步完成对CpG-ODN疫苗佐剂的制备纯化：

CpG-ODN1018的全自动固相合成工艺

固相合成寡核苷酸的原理主要基于化学反应，通过在固相载体上连接适当的合成单元，然后进行后续反应和处理，最终得到目标修饰的寡核苷酸或片段。

CpG-ODN1018的具体的方法包括：

首先，通过酯化反应将合成单元连接到固相载体上；通过脱保护、偶联、氧化和加帽四步循环，每个循环接入一个新的核苷酸，直至合成链长延伸到所需数量的长度，即得到目标寡核苷酸或片段。

全自动核酸合成仪是一种能够快速、准确的合成各种核酸序列的设备。它基于上述固相亚磷酰胺化学法，通过自动控制系统将核苷酸逐个加入到合成柱中，经过一系列的化学反应，最终合成所需的核酸序列。

本次制备合成规模按0.172mmol计，共得到合成产物约2.5g，合成增重1.8g。合成后载体氨解并抽干，所得样品稀释后HPLC进样检测，面积归一化法计算纯度为：84%；得粗品收率为75.1%。

图1：CpG佐剂制备粗品检测色谱图及积分数据

CpG-ODN1018的粗品纯化工艺

取以上合成所得氨解后粗品适量，在Unique AutoPure100蛋白纯化系统上采用离子交换层析进行纯化，按样品出峰顺序依次接取纯化后所得样品共37管，35mL/管，合并主峰收集管，HPLC进样检测得纯度为97%，纯化收率63%。

表1：强阴离子交换层析条件

图2：CpG佐剂合成粗品纯化图谱

图3：CpG佐剂合成粗品纯化后样品HPLC图谱

CpG-ODN1018的超滤浓缩脱盐

取以上纯度满足要求的收集液，采用英赛斯切向流过滤系统AutoTFF075按以下步骤进行超滤浓缩；超滤浓缩后样品HPLC检测纯度为97.7%，超滤脱盐浓缩前后，纯度无明显变化，收率约90%左右。

表2：超滤浓缩工艺步骤

图4：超滤图谱

图5：超滤浓缩后样品HPLC检测图谱

CpG-ODN1018的冻干

以上步骤所得超滤浓缩后样品分配至冻干样品瓶中进行真空干燥冻干。开启制冷、真空泵、真空计。运行过程中冷阱温度：-61.7℃，样品温度：-32.2℃，真空压力：44.8 Pa。冻干得白色绒状固体。

结果与讨论

核酸合成仪的偶联效率是评估核酸合成过程中关键步骤效率的重要指标，它直接影响到合成产物的质量和产量。使用英赛斯Unique AutoOligo 25全自动核酸合成仪进行CpG-ODN1018的合成制备，所得粗品纯度84%，理论22碱基序列合成粗品纯度为80%（按每步偶联效率99%计算），说明每步偶联效率均＞99%，完全满足对CpG-ODN1018的合成制备需求。

使用Unique AutoPure100蛋白纯化系统进行制备后粗品纯化，通过工艺条件的优化，仅一步强阴离子交换层析即可获得纯度96%以上的目标物，回收率60%以上，极大的提高了纯化效率。

使用英赛斯切向流过滤系统Unique AutoTFF075进行纯化后样品的超滤脱盐浓缩，可自动完成浓缩和透析工艺，合并收集液经冻干操作后得到满足纯度要求的固体粉末状终产物。

本案例通过合成、纯化、超滤浓缩和冻干四步工艺完成对CpG-ODN1018的制备纯化，操作步骤简单每个制备阶段都可进行独立的工艺优化，从而实现工艺的灵活放大。

核酸合成作为生物技术领域的核心技术之一，其工艺放大是实现规模化生产、降低成本、提高产品竞争力的关键步骤。

英赛斯Unique AutoOligo大规模核酸合成仪，实现从实验室级别核酸制备到工业级放大生产的完美过渡，采用先进的自动化技术，能够精准控制生产过程中的各项参数，如温度、压力、流量等，确保工艺的稳定性和高效性。这种高精度控制能够显著提升产品的成品率和质量稳定性。

Unique AutoOligo核酸合成仪

Unique AutoOligo是一台灵活直观的全自动的寡核苷酸合成仪，可用于1μmol - 12mmol核酸样品的快速合成。适用于临床研究，医药开发以及分子诊断探针的合成。根据核酸合成量范围的不同，提供多种流速选择方案，样品单体的数量以及柱位同样可根据实验需要做灵活的选择。英赛斯推出以下四个型号的核酸合成仪，满足不同制备规模的客户需求：

Unique AutoOligo25，合成量10 μmol~ 100μmol；

Unique AutoOligo100，合成量50μmol ~ 9mmol；

Unique AutoOligo150，合成量150μmol ~ 12mmol；

Unique AutoOligo600，合成量1mmol ~ 50mmol。

Unique AutoPure蛋白纯化系统

英赛斯Unique AutoPure是一款灵活直观的快速蛋白层析系统（Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC），广泛应用于纯化微克到克级的蛋白、多肽、核酸、多糖等目标物质。

英赛斯Unique CDSystem层析工作站是一款功能强大、性能先进、高稳定性的层析设备控制和数据管理系统，集成了仪器控制、方法管理、数据分析、标准曲线、报告编辑、用户权限管理、审计追踪、数字签名、网络数据库等功能。符合 FDA 21 CFR Part11/GLP/GMP相关法规要求。

Unique AutoTFF075自动化切向流过滤系统

Unique AutoTFF075是一款灵活、自动化的台式切向流过滤系统，可搭配中空纤维、平板膜包等用于抗体、重组蛋白、mRNA、核酸、病毒载体等生物制品的浓缩、透析（缓冲液置换）、纯化、澄清等。其灵活的配置可手动运行，也可实现高度自动化工艺控制，结合完善的数据记录系统，适用于小试工艺开发、工艺放大研究以及小规模样品制备。

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