显微课堂 | 白激光--共聚焦显微镜的理想光源

经典激光源通常仅提供单一的窄带发射。有些气体激光器可以同时发射几种光线。最著名的例子是氩离子激光器，在蓝绿范围内可以提供5条光线。其他激光器，例如染料激光器，虽然可以调谐，但一次仅能发射一种颜色。此外，染料激光器非常不稳定，需要一些耐心才能保持正常运行。有些固体激光器虽然可以调谐，但仅适用红外波段（例如：Ti:Sa激光器）。除了精密度高和价格昂贵之外，他们同样一次仅能发射单一波长的光线，而且调谐流程非常缓慢（需要好几秒）。

随着白激光的诞生，情况已经完全改变，因为它们可以在很大的波段范围内同时发射，而且在聚焦性能方面仍保持着激光的特性^[1]。

这些光源采用光纤式红外激光器，发射约80兆赫的光脉冲。这种化合物称为“种子”，即提供精确的时钟，但能量比较低。脉冲随后在采用二极管泵浦的激光放大器中放大。放大激光器同样基于光纤，且两个系统通过光纤拼接无缝耦合。该放大器的输出红外激光可以达到大约10瓦的平均功率，在80兆赫时，脉宽大约200ps。这些高能脉冲最终聚焦在所谓光子晶体光纤（PCF）的入口表面。这些光纤的主要特征是其中心位置有空心管的图案。这种空心管图案表面的强烈非线性处理，包括群速色散（4阶）、自陡峭、拉曼散射和等离子裂变，导致单色光线扩散到更为广阔的光谱范围，达到蓝色，甚至紫外谱段。

根据PCF的长度，单色红外波峰可以横跨数百纳米的光谱。典型光纤长度为0.5到2米。

图1：左：光子晶体光纤截面。中心的空心管图案就是复杂的非线性光子通过相互作用产生宽能谱光子的位置。

右图：白激光由放大功率后的红外脉冲激光通过光子晶体光纤所产生。PCF是一种超连续谱固体激光发生器。连续谱宽度取决于PCF的长度，外加许多其他工程细节。所有部件均基于光纤，因此天然免维护。图示为PCF出口处的光谱由棱镜产生并投射到一张纸上。

与使用白色光源进行荧光照明的其他显微镜一样，白激光共聚焦显微镜^[2]需要一种方式选择激发波长以激发不同的荧光染料。如有可能，多个激发波长能够同时激发多重染色样品更好。在宽场荧光显微镜中，这项工作由激发滤片执行。具有三到四段带通的二向色镜可以用于多重染色样品。

超连续谱中发出的光束可以提供更加全面的解决方案。声光调制滤片可以从光谱中挑选一条谱线（实际上是窄条带波）并将其偏转到不同的方向。光谱的其他部分直接穿过水晶。条带波的波长可以无极调谐，条带的宽度大约1到3纳米，具体宽度取决于其波长。此类条带波的能量一般是几毫瓦，但已经足以用于成像，甚至经常用于FRAP实验。通过增加更多电子驱动器以便在晶体中产生机械波，同时可以输出一系列颜色，最多可以同时产生八种波长的激发光（但并非技术上限）。这些条带波的波长和强度均可调谐。

这一组合令白激光（WLL）成为共聚焦显微镜的理想光源。它适用于可见光范围内所有已知的可激发染料，并且可以记录激发光谱来探索新染料的光谱性质，尤其是原位光谱。此外，如果出于发射收集的原因或者为了改善相邻染料的分离，它可以任意调谐以实现峰外激发。

图2：采用声光调制滤片从超连续谱光源的白光发射中提取出一系列不同色彩的条带波。这些条带波的颜色和强度均可调谐。对多重染色样品进行平行激发时，必须同时使用一系列条带波。

激发波长的任意调谐不仅带来了巨大好处，还有新的挑战：什么设备可以将无极调谐的光线送进荧光显微镜的光路？最简单的方法就是使用二色分光镜，但这样做的代价是必定会损失一定比例的激发能量，尽管这只能算是一个小问题。该方法的一个严重缺陷是失去珍贵的发射光。即便使用80/20的二色分光镜（通常会浪费4/5的激光能量），也会牺牲五分之一的发射光。

单个分色镜，即便有多个波段，显然也不能支持可调谐光源的优势。采用单次发射的慢调谐非连续光源的方法已经实现商业应用。该系统采用大约10个二向色镜，每个均采用各自的工作频率，在200种颜色范围内仅使用10种，而且可以用于指定波长的两端之外这样可以得到总共30种颜色，但显然不够完美。

完美解决这一困境的方法是使用声光分束器可调谐声光分束器（AOBS）^[3]这一设备允许将一系列彩色条带波送进光路，而将其余光谱引导至不同方向，效率超过95%。若采用多条带波可调谐激光器，人们可以操作AOBS，以便所需激发谱线进入激发光路。

之后，完整的发射光谱会被高效率地发送至检测光路。将激发条带波聚焦到样品上所需的透射光谱空隙与条带波本身的大小相同（因为它们采用相同技术生成），并且可以在他们所处的位置同时控制：只要有人调谐激发波长，相应的空隙就会同步进行电子调谐。用户不需要进行任何操作。

因此，可调谐声光分光器是可调谐多色激发的理想耦合设备。

图3：使用可调谐光源时，仅有自由调谐分光设备可以有效充当激发和发射的分光器。这种声光分光器可以同时无极适应任何给定系列的激发波长。

光谱检测器（SP）旨在对检测到的发射波段的带宽以及中心波长实现完全控制。这可以保证更高的通量（传输效率）以及优化分离。除此之外，光谱检测器还可以记录发射光谱，不论是同时扫描（5通道）还是序列扫描（最多400个频道），也可以是二者结合。过去，发射光谱与安装在系统中的固定谱线激光器绑定在一起。有了白激光（WLL），这种情况完全改变了：由于颜色可以按照1纳米的精度调谐，整个可见光谱内都可获得平滑的激发光谱。结合可以自动控制匹配激发波长的光谱检测器，这项测量工作可以完全自动进行。且这项工作只有通过声光分光器来引导激发光和发射光才可以实现。

同时获取了可调谐激发和可调谐发射之后，下一步是创建有关强度的二维关系图^[4]。需要分离复杂的荧光染料混合物时，这种λ平方图尤其有用。当需要对荧光染料的特性进行研究时，它同样具有普遍的价值：无论是因为他们是新发现或新设计的，还是是因为对微环境条件引起的光谱变化。

荧光由发射强度和荧光寿命来表征。为精确衡量荧光寿命，需要脉冲光源。幸运的是，白激光是一种脉冲光源，且脉冲频率符合典型荧光寿命的要求（即在0.5到5纳秒的范围内）。如果需要更长的脉冲间隔，也可以降低脉冲频率。当然，白激光的可调谐性可以直接显示荧光寿命激发光谱，这包括下一个逻辑结果：二维激发-发射寿命图。

图4：记录了6种不同颜色的混合珠粒。左图：由激发-λ平方扫描记录微球的伪彩色投影。右图：激发-发射图的伪三维视图。我们可以轻松找到六种不同荧光染料的波峰（箭头方向）

最后，这项最新技术还实现了一项功能。混合检测器（HyD）拥有灵敏度高、速度快，动态范围大等特点。它还提供一种门控操作模式。通过与脉冲白激光结合，混合检测器可以在光脉冲之间的时间内检测荧光发射：只需设置HyD的门控时间以便在激光脉冲期间不收集信号。检测到的信号只包含纯荧光信号，并且不含任何反射光。通过这种方法，荧光颜色在与残留反光的对抗时可以轻松获胜。不需要通过为激发波长留出足够的空间来限制发射收集。甚至有可能紧接着激发波长之前以及更远的位置进行测量，这样就可以表征反斯托克斯发射。

脉冲和可调谐光谱白激光光源，与可调谐声光分光器、可调谐光谱检测器以及门控混合检测器结合，是极具吸引力的新技术的融合。虽然下面这段听起来有点老套，但非常应景：它彻底改变了共聚焦显微镜的设计理念和操作。

图5：通过门控检测，可以非常有效而且纯粹地记录来自样品的荧光信号。混合检测器（HyD）可以作为这方面的理想传感器。数据收集分散在整个激发脉冲期间，因此仅收集发射的荧光。左图：记录在492纳米波长下激发时的绿色荧光发射收集490-600纳米。主要信号是反射光，因为激发波长位于发射光收集波段内。右图：相同的激发波长和发射收集波段，但打开门控。没有记录反射光不论发射波段，仅接收纯净、清晰的荧光。

STELLARIS共聚焦显微镜平台

STELLARIS 8 Dive多光子共聚焦显微镜